作者：Gomes, J.V., Singh-Bhagania, S., Cenci, M. et al.
发表日期：2024年3月
发表期刊：Nature

研究背景

为了深入了解糖选择性的分子基础，本文作者表达并纯化了家蚕（Bombyx mori）的味觉受体Gr9（BmGr9），确定了当其唯一的激活配体D-fructose存在和不存在时的结构变化，并通过结构引导的突变和功能测定，展示了D-fructose如何被一个配体结合口袋精确匹配其整体形状和化学基团模式，从而对其包裹。而进一步的计算对接和实验结合测定显示，其他糖也能结合BmGr9，但它们无法激活受体。为了探究其原因，作者通过确定另一种非激活糖L-sorbose的复合物结构，发现尽管两种糖结合在相似的位置，只有D-fructose能够连接两个保守的芳香族残基桥，这个桥连接口袋到孔螺旋，诱导构象变化，使离子导通孔打开。这样的结果阐明了，化学特异性不仅仅依赖于配体结合口袋的选择性，而是同时也由受体-配体相互作用和变构耦合的组合产生，即粗略的受体调谐来自于口袋的大小和化学特性，而受体激活的微调通过选择性参与调节离子导通的变构途径来实现。

实验方法

由BmGr9的Pro2–Ser449残基（天然C末端）组成的合成构建体，被克隆到pEG BacMam载体中，随后连接了氨基末端的Strep-tag II、超折叠GFP和HRV 3C蛋白酶位点。含有BmGr9编码序列的杆状病毒在Sf9细胞中创建。HEK293细胞在37°C的悬浮培养中生长于培养基中，补充有2%（v/v）胎牛血清（FBS）和1%（v/v）GlutaMAX，并在8%（v/v）二氧化碳环境中培养，直到细胞密度达到约3 × 10⁶个细胞每毫升，然后以约1的感染复数转导杆状病毒。12小时后，向培养基中加入10 mM丁酸钠，并将温度降低至30°C。细胞在约48小时后通过离心收集，并在磷酸盐缓冲盐水（pH 7.5）中洗涤一次。细胞沉淀在液氮中冷冻并储存在–80°C，直到需要时使用。

细胞沉淀在冰上解冻，并以每克细胞20毫升裂解缓冲液重悬。裂解缓冲液由50 mM HEPES–NaOH（pH 7.5）、375 mM NaCl、10 μg ml⁻¹ DNase I、1 μg ml⁻¹亮肽素、1 μg ml⁻¹抑肽酶、1 μg ml⁻¹ pepstatin A和1 mM苯甲基磺酰氟组成。通过加入1%（w/v）n-十二烷基-β-d-麦芽糖苷（DDM）和0.2%（w/v）胆固醇半琥珀酸酯（CHS）在4°C下提取BmGr9 2小时。混合物通过80,000g离心澄清，将上清液加至每克细胞 0.4 ml StrepTactin Sepharose 填料（Cytiva）中，并在4°C下旋转1小时。收集填料，用20 mM HEPES–NaOH（pH 7.5）（含有0.02%（w/v）DDM和0.004%（w/v）CHS 的150 mM NaCl（HEPES缓冲盐水（HBS））洗涤10个柱体积，然后用含有0.05%（w/v）地高辛的HBS洗涤10个柱体积。通过向地高辛缓冲液中加入2.5 mM去硫生物素洗脱BmGr9。

通过加入10 U mg⁻¹ BmGr9的HRV 3C蛋白酶在4°C下过夜切割StrepII–GFP标签，将BmGr9在离心管（100 kDa 截止）中浓缩，并注入预先用含有0.05%（w/v）地高辛的HBS平衡的Superose 6 Increase预装柱（Cytiva）。对于糖结合样品，缓冲液中包括0.5 M D-fructose或1 M L-sorbose。含有纯化BmGr9的峰组分被浓缩至4.7 mg ml⁻¹（未结合样品）、2.9 mg ml⁻¹（果糖结合样品）或4.6 mg ml⁻¹（山梨糖结合样品），并随后通过冷冻电镜确定其结构。

产品信息

Reference
Gomes, J.V., Singh-Bhagania, S., Cenci, M. et al. The molecular basis of sugar detection by an insect taste receptor. Nature 629, 228–234 (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07255-w