学术界和行业领导者分享关于从技术到工作方式等话题的见解
本文改编自最初发表于https://www.genengnews.com的赞助内容。
腺相关病毒 (AAV) 现已成为极具灵活性、用途广泛的基因疗法载体。目前有数百项基因疗法试验正在开展，安全、高效地生产 AAV 变得无比重要。
在本次圆桌讨论中，四位学术与行业专家共聚一堂，讨论了优化与放大 AAV 生产管线以满足对这些不可或缺的病毒载体递送系统日益增长的需求所面临的挑战。
感谢加利福尼亚大学旧金山分校生物化学与生物物理学助理教授 Nicole Paulk 博士、瑞典乌普萨拉 Cytiva 客户应用总监 Mats Lundgren 博士、瑞典斯德哥尔摩 Biovian 全球业务开发部负责人 Magnus Gustafsson 博士和马里兰州 AAVnerGene 总裁兼首席执行官 Daozhan Yu 博士参与本次重要对话。
问题 1：AAV 已成为基因递送的主要载体。这种病毒载体所带来的机遇和挑战是什么？
Paulk: 最大的机遇是扩大我们目前的能力范围，将 AAV 用作治疗单基因罕见病与超级罕见病的基因组药物递送工具。我开始听到更多人讨论扩展到多基因疾病和病因更复杂的疾病治疗领域。扩大治疗领域以惠及更多患者，并解决期间遇到的挑战，这就是最大的机遇所在。我们还需要深入研究安全给药问题，比如当我们试图递送到全身组织时高剂量的安全给药。然后就是始终存在的生产问题：我们的产能是否能覆盖全球患者的供给需求，例如治疗糖尿病或充血性心脏衰竭等常见病？
Lundgren: 整个领域都在不断发展变化。新血清型不断被发现或合成新变体。今后面临的机遇更多，但生产却非常困难，尤其是在高剂量时。
Gustafsson: 40 年前获批的首个抗体是取自杂交瘤细胞的小鼠抗体。如今我们采用转基因小鼠表达人类抗体。期间我们采用过嵌合抗体和人源化抗体。随着 mAb 滴度的不断增加，此类药物的用途会变得更加广泛。给世界带来了革命性的变化。AAV 的影响力才刚刚显现。目前转染可能是生产 AAV 最快的方法，但却不是最经济、最稳健、或最安全的方法。未来会有更多的技术影响生产。其推动力在于技术创新，而不是药物本身。
Yu: 我们有很多机遇，AAV 不仅可以治疗罕见病，还可以治疗许多常见疾病，例如糖尿病、阿尔茨海默病、衰老，甚至 COVID-19。只需替换目标基因和衣壳即可制成一种新药。其潜力是无限的。生产将是一个长期存在的问题，因为不断涌现的基因疗法公司需要大量的 AAV。但是，有些基因疗法公司认为 AAV 非常安全，可以随意增加剂量。去年，FDA 叫停了多项临床试验，其中大多数与生产问题有关。患者使用的药物剂量过高。已有多名患者因 AAV 治疗剂量过高而死亡。由此带来的巨大挑战可能延误该领域的发展，甚至毁掉该领域。高剂量风险是主要问题。我们的重点不仅仅是增加生产量，而是提高生产效率。
问题 2：目前大批量生产病毒载体仍是一项挑战。我们都知道获得 AAV 需要等待很长时间。如何解决这种生产缺口问题？近期 AAV 生产管线领域的哪些创新技术可以帮助缩短生产时间？
Paulk: 目前我们解决这个问题的办法主要是从短期角度考虑，因为我们的需求非常迫切！患者在等待救治，同行需要启动计划。在短期内需要建立更多的设施和更多的生物反应器，才能满足需求。但是同行们已开始更多地从长远角度考虑问题。这就好比使用创可贴™ 临时包扎完伤口，但长期该怎么办呢？这就需要彻底地改变 AAV 的生产理念。这可能需要我们不用生产单克隆抗体 (mAb) 的方式来生产 AAV。
Lundgren: 每个 CMO 企业和 CDMO 企业都在努力扩大产能，但这并不意味着所有公司都具备专业技术和经验。选择信誉良好、具备适当专业技术的 CDMO 非常重要。Biovian 就是一个很好的例子。工艺方面将会有巨大的改进：能进行结构性表达的生产细胞系，改进细胞培养方式，以及增加病毒数量的办法。大家都在努力提高完整衣壳的百分比。下游纯化工艺将得到改善。而如何纯化完整衣壳、如何进行制剂开发以及如何实现稳定化保存，都是需要解决的问题。
Gustafsson: 需求的大幅增加源自临床试验数量增多。其背后原因是 AAV 载体的递送效果好。药物剂量之所以较高，是因为制药公司选择全身性递送而不是局部给药，并且研究的患者群体更大。不同的应用对于载体数量的需求差异巨大。我们需要想办法进行调整，以适应这种巨大差异。我们还面临着产能紧张的问题，目前的解决方法是对反应器进行纵向扩展（提升单机规模）或横向扩展（增加设备数量）。我们存在财务困难，因为需要有人买单。生物反应器过大并不可行。因为存在技术困难。我们需要滴度更高、效率更高、对不同组织特异性更好的载体，同时还存在时间紧迫的问题。多年来，Cytiva在mAb和病毒载体设备生产方面一直发挥着重要作用。在技术开发方面，学术机构发挥了重要作用，为我们提供了更好的工具。
Yu: 目前业界正在开发许多技术。以我的合作伙伴 Wang 博士开发的 AAV 生产技术为例。该技术的 AAV 产量非常高，而且可以很容易进行放大。我们从抗体生产商那里借鉴了许多技术。但是，AAV 生产比小分子和大分子药物生产更加复杂。正如前 FDA 专员 Scott Gottlieb 所说，对于 AAV 基因疗法，我们应更多关注产品生产与质量本身。它不同于传统的药物开发。虽然可以运行更多的生物反应器并提高容积，但 AAV 的可放大性并非易事。许多企业不具备足够的专业技术。我们仍在使用质粒转染方案，这种方法下的细胞容易聚集。有些公司正在开发更有效的新转染试剂。
问题 3：整个工艺流程的可放大性面临哪些挑战？
Lundgren: 瞬时转染仍是一种非常好的方法，这种方法可以获得优质材料，但问题是很难实现规模放大。另外一些系统更容易放大规模。例如腺病毒系统对于培养悬浮细胞的效果就非常好。可以先用腺病毒感染悬浮细胞，然后在下游工艺中去除腺病毒。在不久的将来就会有生产细胞系，但这要成为现实并非易事。因为许多创新技术来自学术机构，所以这些技术本质上是小规模的。而且有些步骤可能很难放大规模。例如，超速离心很难实现规模放大，因为超速离心需要使用巨大的离心机，而且离心机很难清洁。因此，目前的趋势是放弃使用超速离心，更多地采用过滤和层析技术。采用过滤和层析技术的另一个关键考量在于安全，通过构建封闭式系统，可以杜绝交叉污染。未来的发展趋势是封闭式和可放大性系统，同时尽量提高滴度、纯度及材料的效价。
Gustafsson: Biovian 同样面临这个问题。我们有的客户开始采用小规模，后来想要转换成更大规模。作为一家 CMO，我们按照客户的要求去做，但如果我们有机会开发工艺，我们会尽量采用悬浮培养，因为这种方式可放大性更强。我们选择 Cytiva 作为我们的供应商。我们采用了他们的可放大性 Xcellerex™ 系统，还有同样具有可放大性的ÄKTA™ 纯化系统。如果你选择三重转染，则还必须放大质粒生产。这就成为了瓶颈。生产病毒需要大量的质粒，我们可以利用稳定的细胞系进行放大，并使用病毒载体转导 AAV。纯化非常重要。如果有不受血清型限制的一次性超速离心系统固然好，但这种系统目前并不存在。因此我们选择了可放大性的层析系统。
问题 4：成本仍是一个痛点，尤其从工业化角度来看。如何在保持严格的安全标准的同时，提高 AAV 生产的成本效益？
Paulk: AAV 成本高的一个主要原因是剂量高。短期内降低价格的最好办法就是减少剂量。为此，需要通过创新技术来提高效能，从而减少剂量。除此之外，还需要制作一种全新的组织培养基，其成本为目前成本的 1/10,000。而这需要更大规模的创新技术，可能需要数年才能实现。在短期内，我们可以想办法寻找滴度略高的衣壳，设法提高回收和截留能力，减少纯化过程中的损失，想办法从一开始就提高完整衣壳数量。从长期来看，我们需要完全转变 AAV 的生产思路，采用无细胞系统，不使用质粒、生物反应器、细胞或组织培养基。这是普通的试管就能做到的吗？
Lundgren: 在生物学领域，一旦发现更有效的技术，产生的影响是巨大的。成本也会随之降低。但对于工艺而言，我们要着眼于工艺放大。例如，我们可以采用灌流系统培养细胞，这样可以提高反应器中的细胞数量，提高单位体积的生产率。我们可以尝试开发平台式纯化工艺，避免每次更换病毒时进行调整。耗材—我们怎样能够生产更经济的培养基、更好的生物反应器？尝试发现容易部署的可放大性平台工艺，同时保持安全性与有效性，这是非常重要的。从长期来看，我们可以开发无细胞生产系统。尽管这些病毒非常小，但仍比 mAb 复杂许多。
Gustafsson: 我们需要全面地看待该技术平台。不可以采用一刀切的方式。我们可能需要考虑五个方面的问题：病毒本身、质粒、细胞系、纯化、生产系统。目前我们使用未经修饰的质粒，不过你也可以使用纳米质粒、微环或滚环扩增。质粒必须实现双平台定制化开发：既要适配大肠杆菌 表达要求，又要满足终端应用细胞的环境兼容性。也可以不用质粒，使用病毒进行转导，例如杆状病毒。还可以使用种子种群。至于细胞系，大约有 160 种不同的 HEK293 细胞系。我们需要选择其中较好的细胞系。还可以使用其他细胞系：CAP™ 细胞系、PER.C6®、HeLa。还有稳定的细胞系、以及可以将 AAV 运送到胞外或分泌到胞外的细胞系。如果开发出来这种技术，就可以连续生产 AAV。我们都在关注悬浮和贴壁生产系统，但建立一个不会使细胞裂解的可持续工艺体系极为重要。最好采用具有更好、更多、血清型非特异性配基或离子交换层析将完整衣壳与空衣壳分离开。分析工具非常重要，可以查看工艺开发并分析结果。分析时最好采用具有 AI 功能的高通量电子显微镜检查作为判断依据。
Paulk:我们假设 AAV 的定价主要基于生产和工艺开发成本，但是还有其他成本。作为一家 AAV 基因疗法公司，在确定价格时需要考虑员工和临床试验成本。为了降低定价，可以降低上述成本。前期投入的所有工作都非常重要。如果最终临床或临床前试验暂停，你需要收回这些时间和成本。无论是在学术研究阶段还是产业化初期，在载体骨架、启动子、反向末端重复序列 (ITR) 等前期技术设计的决策方面投入越多时间，越有利于后期工作。
问题 5：您如何看待学术机构与企业在 AAV 生产方面持续开展沟通与合作？
Paulk:我们看到有更多的企业资金正投向学术机构。但问题是企业给你投资通常都带有附加条件，即你或隐或显地觉得有必要用这笔钱为该公司生产。我们必须确保学术团队始终能够自由地开展研究、自由地发表结果（无论对公司有利还是有弊）、自由地提交数据，剥离商业利益与科研活动的潜在关联，才能避免自食恶果。
Lundgren:我们给你钱，你按我们的要求开展研究，这种做法有害无益。好的合作方式是围绕痛点、可预见的问题开展科学讨论。过度依赖行业投资是非常危险的。我们与研究机构开展的生产技术研究合作之所以取得成功，是因为我们不为他们提供资金，而是共同工作。为了展示他们在分子方面所做的工作，我们或许会为他们安排大规模生产。作为企业，我们肯定无法解决生物学方面的问题。尽管企业与学术机构之间可以在分析领域行合作，但要保持自由的学术创新精神。
Gustafsson:最好能融合学术智慧与商业资源，构建开源性的病毒载体平台工艺开发项目。就像 Linux 这种开源性的学生开发项目。我们在人类基因组测序方面已经有过这种合作。我们都在努力降低初始成本，最好是能建立一个人人都可以使用的基础平台。