我们开发了重组腺相关病毒血清型 5 (rAAV5) 生物反应器生产工艺，涵盖从冷冻管到纯化、无菌过滤批量生产的整个流程。该工艺为封闭式设计，基于 HyCell™ TransFx-H 培养基的无血清培养。不使用任何动物源性成分，整个过程符合 GMP 要求。
本文详细阐述了如何将 HEK293/HEK293T 悬浮细胞从使用摇瓶的小规模细胞培养 (20 mL) 扩增至使用台式 Xcellerex™ XDR-10 一次性生物反应器系统的 10 L 培养。通过生物反应器内的瞬时质粒转染，可生产高滴度的 AAV。我们还在 ReadyToProcess WAVE™ 25 生物反应器系统中生产了 rAAV5，规模可达 20 L。此外，我们提供的数据表明，除了 AAV5 之外，该工艺还适用于 AAV2、AAV8 和 AAV9 等其他血清型。
简介
病毒载体被越来越多地用于将基因移至特定组织或诱导细胞类型修饰。已经研究了数种病毒在cell and gene therapy中的用途，其中重组腺相关病毒 (rAAV) 是广泛用于基因疗法的载体。
基因治疗制造业面临的一项重大挑战是按照现行药品生产质量管理规范 (GMP) 建立大规模生产。病毒载体的监管要求仍在不断发展，并预计会日趋严格。
重组 AAV (rAAV) 生产领域的另一趋势是逐步放弃使用贴壁 HEK293 细胞，而是转向基于悬浮 HEK293 细胞的可放大性封闭式生物反应器技术。这些技术通过瞬时转染技术生产高滴度 rAAV。
在本研究中，选择 rAAV5 血清型来展示 rAAV 的生产。HEK293T 细胞在 HyCell™ TransFx-H 中按之前我们所介绍的方法驯化至悬浮状态，并适应无血清条件，然后通过转染用于产生 rAAV5。驯化后的 HEK293T 细胞在 Xcellerex™ XDR-10 和 ReadyToProcess WAVE™ 25 生物反应器中扩增和放大，用于生产 rAAV5。一次性生物反应器具有多种优势，成为病毒载体生产的首选工艺设备。例如，由于批次之间转换程序缩短，交叉污染风险大幅降低，产能也得以提高。此外，一次性生物反应器还提升了生产工厂的灵活性和可放大性。
采用聚乙烯亚胺 (PEI) 作为 DNA 转染试剂，通过三质粒共转染系统对 HEK293T 细胞进行转染。为了成功生成功能性病毒颗粒，需要将所有三种质粒以适当比例共转染至细胞。我们在本研究中使用的三种质粒为：
(1) 含 GFP 报告基因的 pAAV-GFP 对照质粒
(2) 含 GFP 报告基因的 pAAV-GFP 对照质粒
(3) 含复制蛋白和 AAV5 特异性衣壳蛋白的 pAAV-RC5 载体质粒
如何使用实验设计 (DoE) 方法优化转染条件，请参见我们之前发表的文章。
研究目标是在粗收获材料中实现1010病毒基因组 (VG)/mL (1013/L) 和 1011病毒颗粒 (VP)/mL (1014/L)。这些标准基于文献中描述的水平。对于完整衣壳的百分比，我们要求收获材料中至少含 10% 的完整衣壳，以便在纯化过程中能高效分离完整衣壳与空衣壳。完整衣壳的百分比通过 VG/mL 与 VP/mL 的比值计算得出。
详细的材料和方法见文末。
在 10 L 规模的生物反应器中进行验证运行
在我们的 rAAV5 生产过程中，我们首先采用摇瓶进行小规模细胞培养，然后在一次性生物反应器中扩增细胞。在工艺开发阶段，我们开发了一种专门用于大量生产 rAAV5 的转染方法。
如上所述，我们需要收获材料中至少含 1010VG/mL (1013/L), 1011 VP/mL (1014/L)且完整衣壳含量超过 10%。完整衣壳的百分比通过 VG/mL（采用 qPCR 分析）与 VP/mL（采用 ELISA 分析）的比值计算得出。
在最终工艺前，我们使用 XDR-10 和 WAVE™ 25 生物反应器进行了 10 L 规模的验证运行，以确保转染方案能达成 rAAV5 的生产目标。
生产批次验证的结果如图1所示。这些初始批次满足所有预期标准。
图1.使用 Xcellerex™ XDR-10（左）和 WAVE™ 25 生物反应器（右）在 10 L 规模下的 rAAV5 验证批次证实，制定的转染方案可实现 rAAV5 的生产标准。
使用 XDR-10 生物反应器的生产
XDR-10 生物反应器中 rAAV5 的生产总结如下：
首先，扩增细胞以生成 XDR-10 生物反应器的接种液。HEK293T 细胞在摇瓶中扩增，以 5.5 L 起始体积达到 0.4 × 106个细胞/mL 的接种细胞浓度。
XDR-10 生物反应器经调试后，用于接种和培养 HEK293T 悬浮细胞，目标细胞密度约 2 × 106个细胞/mL。通过添加 4 L 完全 HyCell™ TransFx-H 培养基稀释细胞，使工作体积达到 9.5 L。
按照优化方案进行转染，并将转染复合物溶液添加至生物反应器中，最终生物反应器体积为 10 L，细胞浓度为 1 × 106个细胞/mL。
XDR-10 生物反应器中三个生产批次的结果如图 2 所示。与运行 2 和 3 相比，运行 1 使用了不同的喷射器，这可能导致运行 2 和 3 的氧合效果更好，进而表现为活细胞密度 (VCD) 和细胞活力的提升。
图2. Xcellerex™ XDR-10生物反应器中三个rAAV5生产批次的总结。
转染效率结果分析
为了确认 XDR-10 生物反应器中的转染效率，除了流式细胞仪分析外，我们还对细胞进行了明视野和荧光显微观察。图 3 显示了收获时 rAAV5 稀释样本中的 GFP 阳性荧光细胞。
(A)
(B)
图3.rAAV5 稀释样本在从 XDR-10 生物反应器中收获时的 (A) 明视野和 (B) 荧光显微镜图像。
生产批次的病毒滴度相似，约为 1014 VP/L，且所有三个生产批次均成功产生 > 10% 的完整衣壳（图 4）。三个批次之间的一致性表明，该工艺设计稳健且适合于生产用途。
图4.XDR-10 生物反应器中三个生产批次总结。就病毒基因组、病毒颗粒和完整病毒衣壳百分比而言，rAAV5 生产符合所有标准。
使用 WAVE™ 25 生物反应器的生产
我们希望测试 WAVE™ 型一次性生物反应器（摇摆运动）是否可以用作 XDR（搅拌罐设计）的替代方案。因此，我们需要验证 AAV 瞬时转染方案的性能以及在 WAVE™ 25 生物反应器中的生产。
首先，在摇瓶中培养并扩增 HEK293T 细胞，以 10 L 起始体积获得 0.4 × 106个细胞/mL 的接种细胞悬液。
WAVE™ 25 生物反应器经调试后，用于接种和培养 HEK293T 悬浮细胞，目标密度约为 2 × 106个细胞/mL。
通过加入 9 L 新鲜补充的 HyCell™ Trans-Fx-H 培养基稀释细胞，使工作体积达到 19 L。
按照优化方案进行转染，并将转染复合物溶液添加至生物反应器中，至最终体积为20L，细胞浓度为1×106个细胞/mL。
在 WAVE™ 25 生物反应器的三个生产批次中，我们细胞生长和活力方面观察到了可重复的结果（图 5）。
图5.WAVE™ 25生物反应器中三个rAAV5生产批次的总结。
对于 WAVE™ 25 生物反应器中的 rAAV5 生产批次，我们还评估了可放大性——在运行 1 和运行 2 中，我们的细胞培养体积更大，达 20 L，而在运行 3 中为 10 L。我们为不同生产批次设定的病毒基因组、病毒颗粒和完整衣壳百分比标准在更大规模下均得到满足（图 6）。
图6.WAVE™ 25 生物反应器中三个生产批次总结。就病毒基因组、病毒颗粒和完整病毒衣壳百分比而言，rAAV5 生产符合所有标准。
因此，我们可以确认WAVE™ 25也适用于AAV生产，其生产力与XDR-10生物反应器相似。尽管两种生物反应器均取得良好结果，但 Xcellerex™ XDR-10与ReadyToProcess WAVE™ 25相比，该工艺的优势在于，Xcellerex™ XDR系列可实现高达2000L的可放大性。
rAAV2、rAAV8 和 rAAV9 生产的可放大性工艺
AAV 领域的研究和开发非常活跃，旨在提高有效性和组织特异性以及减少一些潜在的安全性问题。目前有许多天然以及合成/人工改造的血清型处于不同开发阶段。我们还进一步评估了现有转染方案对于 rAAV5 以外的其他血清型的适用性，以及可放大性。
图7显示，除了rAAV5之外，rAAV2、rAAV8和rAAV9血清型从摇瓶到生物反应器也具有良好的可放大性和生产力。根据这些结果，我们得出结论，本文所述的生物反应器放大转染方案可支持多种 AAV 血清型的大规模生产。
图7.各种AAV血清型转染方案的可放大性。
结论和讨论
如本研究所示，我们开发了一种符合 GMP 生产监管要求的封闭式生物反应器工艺，实现了AAV载体的规模化生产。细胞培养基不含血清，且未使用任何动物源性成分。我们在 XDR-10 生物反应器中完成了三次具有可比性的 rAAV5 生产运行，均满足了我们为完整上游工艺设定的验收标准。结果表明，该工艺稳健，并证实转染后 72 小时的收获时间适合生产。结果显示，该工艺可实现从小规模摇瓶至10L XDR生物反应器的平稳放大。
在小规模生产中，与摇瓶相比，使用 Xcellerex™ XDR-10生物反应器执行工艺的优势在于，pH值和DO可严格控制在您的预设范围内。
此外，我们已证明使用 WAVE™ 25的AAV生产规模高达20 L，且结果良好。WAVE™ 25生物反应器操作相对简单，可在早期临床前开发中提供AAV材料，但对于大规模GMP生产，Xcellerex™ XDR生物反应器系列的操作规模可达2000L。
值得注意的是，针对rAAV5开发的转染方案也适用于其他AAV血清型，例如AAV2、AAV8和AAV9。我们相信，本文所述的生产技术只需稍加修改即可用于所有天然或人工改造的血清型。
材料和方法
HEK293T 悬浮细胞的细胞培养
我们使用 HyClone™ 转染培养基HyCell™ Transfx-H对贴壁HEK293T细胞进行悬浮培养。HEK293T悬浮细胞每周常规传代三次，接种液VCD为0.2至0.3×106个细胞/mL。使用Vi-CELL™细胞计数器(Beckman-Coulter)对细胞进行计数，并将细胞接种于装有新鲜培养基的新摇瓶中（E125/E250 摇瓶）。培养基中加入了4 mM L-谷氨酰胺和0.1% Pluronic™ F-68(BASF SE)。
转染
rAAV5 通过 HEK293T 细胞的瞬时转染工艺生产，采用三质粒系统和PEI max(Polysciences)，确保仅在所有三个质粒同时转染至宿主细胞时，才能产生功能性rAAV5病毒颗粒。
简言之，操作步骤如下：将 DNA 溶液与培养基混合，然后将 PEI 试剂加入 DNA 混合物中，同时轻轻地来回旋转转移瓶。PEI/DNA 混合液在室温下孵育 15 分钟，形成 DNA 复合物。孵育期间，将装有 PEI/DNA 混合液的转移瓶通过焊接管路连接至生物反应器。在转移瓶中施加超压，缓慢将转染混合物转移至生物反应器。我们知道孵育时间是获得收获材料中大量完整衣壳的重要参数，因此需在 15 分钟内高效将转染溶液转移至生物反应器。
72 小时后，收集生物反应器中的样本，并使用流式细胞术进行分析，以确定转染效率。细胞裂解后，取样并以 850 × g 离心 10 分钟。制备等分试样，通过 qPCR 分析病毒基因组滴度，并通过 ELISA 分析病毒颗粒。
最终的转染方案和参数如下表 1 所述：
表1.转染方案采用的最终参数
| 参数 | rAAV |
| VCD (× 106/mL) | 1 |
| DNA 浓度，总 DNA (µg/mL)1 | 0.75 |
| DNA 比例：a:b:c | 1:1:2 |
| a | pAAV-RC5 载体: 1 |
| b | pHelper: 1 |
| c | pAAV-GFP vector: 2 |
| PEI/DNA 比 (µL: µg) | 2:1 |
| 转染体积 | 总体积的 5% |
| 孵育时间（分钟） | 15 |
| 转染温度 | RT |
| AAV 生产温度 | 37°C |
| 收获时间 (ToH)（小时） | 72 |
使用表 1 中的优化参数，在生物反应器中生产 rAAV5 的转染方案如下:
第 0 天：
将 HEK293T 细胞悬浮液以0.4×106个细胞/mL的浓度接种于生物反应器中，占最终培养体积的55%。
第 2 天，转染:
- 加入完整 HyCell™ TransFx-H 培养基至最终体积 (10 L)，细胞密度为1×106个细胞/mL。
- 在无菌烧瓶中，采用不含血清和补充剂的培养基制备0.75μg/mL的总DNA，配置体积为最终生产体积的5%。
- 向DNA混合液中加入PEI（DNA:PEI比例为1:2），并通过来回轻轻旋转转移瓶进行混合。
- 在室温下孵育15分钟。
- 通过焊接管路至生物反应器将转移瓶与生物反应器连接，并继续在转移瓶内施加超压，以将转染混合液缓慢转移至生物反应器。
第 5 天，转染后 72 小时:
- 转染后 72 小时，37 °C 下收集样本，并通过流式细胞术和显微镜检查转染效率。
- 2. 加入培养体积 1/10 的裂解缓冲液(1.65 M NaCl, 5.5% Tween™ 20, 11 mM MgCl2)并孵育 20 分钟，从而裂解生物反应器中的细胞。
- 并孵育 20 分钟，从而裂解生物反应器中的细胞。
- 裂解后收集样本作为起始参比样品。收集剩余材料用于进一步下游处理。
XDR-10 生物反应器条件
Xcellerex™ XDR-10 生物反应器用于生产 10 L rAAV5 的参数设置如表 2 所示。pH 设定值为 7.1，采用系统默认比例-积分-微分 (PID) 参数，通过CO2 和 NaHCO3控制。DO 设定值为 40%，采用系统默认 PID 控制参数，通过富氧空气控制。
表 2.XDR-10 生物反应器中 AAV5 生产所用参数设置总结
| 参数 | 设置/备注（XDR-10 生物反应器） |
| 生产培养基 | HyCell™ TransFx-H 转染培养基（添加 4 mM 谷氨酰胺，含 0.1% Pluronic™ F68） |
| 起始活细胞浓度 | 0.4 × 106个活细胞/mL |
| 灌装体积 | 4.5 L |
| 接种体积 | 1 L |
| 转染混合液 | 500 mL |
| 操作体积 | 10 L |
| 叶轮/摇床转速 | 140 rpm，向上泵送 |
| 温度 | 37°C |
| pH设定值 | 7.1 (通过CO2和碱进行控制) |
| 控制 pH 值所使用的碱液 | 7.5% (w/v) NaHCO3 |
| DO设定值 | 40%（通过富氧空气进行控制） |
| 喷射器 | 1 mm：空气，CO2
2 µm：空气，O2 |
| 氧气流速 | 通过比例-积分-微分 (PID) 进行控制 |
| 二氧化碳流速 | 通过 PID 进行控制 |
| 消泡剂 | 不适用 |
ReadyToProcess WAVE™ 25 生物反应器
ReadyToProcess WAVE™ 25 生物反应器根据 ReadyToProcess WAVE™ 25 用户手册和检查清单进行准备和运行。生物反应器设置见表 7。本实验中使用的生物反应器包含以下组件：
- 1 × ReadyToProcess WAVE™ 25 摇床
- 1 × ReadyToProcess™ CBCU
- 1 × 50 L Cellbag™ 生物反应器（以下简称 Cellbag™）
- UNICORN™ 软件
生产 20 L rAAV5 的操作流程如下。接种前，将 50 L Cellbag™ 充满空气，并通过袋体上的一个端口将 5 L HyCell™ TransFx-H 培养基无菌加入生物反应器。于 37°C 和5% CO2下平衡过夜。平衡期间搅拌速率设为 15 rpm。接种细胞前，进行 pH 值偏移校准。
起始 VCD 的目标是0.4 × 106个细胞/mL，转速增加至 20 rpm，角度调整至 6°。约 30 分钟后取样并测量细胞密度（起始密度），之后每 24 小时取样一次测定细胞密度。
两天后，用预热 HyCell™ TransFx-H 培养基稀释细胞（培养基中添加了 4 mM L-谷氨酰胺和 0.1% Pluronic™ F-68），使细胞密度达到 0.8 至 1.2 × 106个细胞/mL，总体积为 20 L。摇动速度增加至约 22 rpm。随后进行 rAAV5 转染，三天后收获细胞并进行裂解和澄清处理。
表 3.WAVE™ 25 生物反应器中生产 20 L rAAV5 所用的参数设置
| 参数 | 设置，WAVE™ 25 生物反应器 |
| 培养基 | HyCell™ TransFxH 培养基（添加 4 mM 谷氨酰胺） |
| 起始活细胞浓度 (VCD/mL) | 0.4 × 106 |
| 起始体积 (L) | 5 至 6 |
| 接种体积(L) | 10 至 12.5 |
| 操作体积(L) | 20 至 25 |
| 转染体积（占总体积的百分比） | 总体积的 5%（1.00 至 1.25 L） |
| 摇摆运动 (rpm) | 15 至 25 rpm |
| 角度(°) | |
| 角度 | 37°C |
| 气体流速 | 0.2 Lpm |
| pH设定值 | 7.1 (通过CO2控制) |
| 控制 pH 值所使用的碱液 | 不适用 |
| DO设定值 | N/A（因培养时间较短无需设置） |
| O2 | N/A（因培养时间较短无需设置）O2浓度控制在 21% 至 50% 之间（测量范围 0% 至 50%） |
| CO2 | 气体混合物中的CO2浓度控制在 0% 至 15% 之间（测量范围 0% 至 20%） |
细胞密度和活力
使用 Vi-CELL™ XR (Beckman Coulter) 的 HEK293.sus 程序测量细胞数量和活力。该仪器采用的原理是将细胞进行台盼蓝染色，并对死细胞（染色细胞）和活细胞（未染色细胞）进行计数。使用 NucleoCounter™ NC200™ 自动细胞计数器 (Chemometec) 估算聚集体。
pH (离线)
使用 SevenCompact S210 (Mettler Toledo™ Inc.) 进行离线 pH 测量。每天使用 pH 4.0 和 pH 7.0 校准溶液校准 pH 计。将离线值与在线值进行比较，若差异为 ±0.1，则进行校正。
形态学
通过 Nikon Eclipse TE2000e 倒置显微镜 (Nikon™ Corp.) 在明场模式下观察细胞形态，从而直观地监测细胞形态和病毒感染。使用荧光滤光片检测表达绿色荧光蛋白 (GFP) 的细胞，以检测表达 GFP 的病毒产生情况。
流式细胞仪
流式细胞术可用于快速分析悬浮液中大量单个细胞或颗粒的不同物理、化学或荧光特性。本研究采用流式细胞术评估转染效率，因为转染的细胞表达 GFP 蛋白。但是，这仅表明 GFP 质粒转染细胞的占比，其数值与收获液中实际病毒滴度无必然相关性。
qPCR
为确定样本中的病毒滴度，我们采用 qPCR 检测方法，通过测量 rAAV5 生产中的病毒基因组拷贝数/mL 来实现。用于滴度测定的引物靶向作用于病毒基因组的 CMV 启动子区域。
ELISA法
使用 Progen 的 rAAV5 滴定 ELISA 试剂盒分析 rAAV5 的产生情况。