应对疫情的过程凸显了加速疫苗研发的重要性。在这一具有里程碑意义的时刻，获批的首批 COVID-19 疫苗最终扭转了这场全球健康危机的走向，同时也展示了信使 RNA (mRNA) 疗法的快速反应潜力。
尽管 COVID-19 疫苗所采用的 mRNA 技术似乎在一夜之间取得成功，但这些制剂却是数十年来对 mRNA 安全性和潜力进行创新性科学研究的结果。然而，长期以来的一项挑战是：如何在保持安全性和有效性平衡的同时将高敏感 RNA 分子送入细胞而不被降解。
脂质纳米颗粒 (LNP) 解决了研究人员多年来面临的诸多问题，是 mRNA 疫苗成为现实的关键因素。COVID-19 的 mRNA 疫苗推动了基于 RNA 疫苗开发的爆炸式增长，同时也使 LNP 成为基于复杂多核苷酸和肽的疗法的主流药物载体。
COVID-19 疫苗中使用的 LNP 由带正电荷的可电离脂质等四种组分组成，这些脂质可与带负电荷的 mRNA 分子发生静电相互作用。LNP 外壳可有效包裹 mRNA，形成一道针对代谢酶的保护屏障。LNP 模仿内源性低密度脂蛋白 (LDL)，通过内吞作用进入靶细胞。在细胞内，pH 值敏感性的可电离脂质促进内体逃逸并将 mRNA 有效载荷释放至细胞质中。
虽然 LNP 是一种复杂的递送系统，但其具有良好的毒性特征、能够高效封装各种基因组有效载荷（或多种有效载荷），并且可以设计成靶向特定的细胞类型，这些特点为新兴纳米药物带来了新的机遇。
LNP 工艺开发和制造的关键考虑因素
随着全球对 LNP 的兴趣与日俱增，对 LNP 的需求也达到了历史新高。从小众应用到主流应用的转变增加了对 LNP 生物工艺开发和投资，以建立可靠、稳健、可放大和合规的生产工艺。随着质量源于设计 (QbD) 和实验设计 (DoE) 方法在工艺开发中的应用势头增强，垂直（上/下）可放大性平台生产技术、预测工艺模型和自动化将提供深度的工艺知识。
制造商需要对上游和下游步骤进行大规模评估，以深入了解整个生产工作流程的端到端流程。该评估对于确定工艺或分析变化对产品关键质量属性 (CQA) 造成的任何差距或意外影响至关重要。对于纳米颗粒，下游制剂和灌装操作的规模扩大会对其功能性和稳定性产生巨大影响。因此，关注下游考虑因素事关商业化道路上的成败。
下游工艺开发对生物活性的影响
虽然工艺开发的目标是确定和优化关键工艺参数，同时确保工艺的可放大性从而取得长期成功，但基于 LNP 的纳米药物的尺寸和复杂性会给生产带来挑战。
纳米颗粒的形态可能受下游过滤工艺影响，从而影响最终药品的生物活性。因此，透彻了解如何以稳健、可重复的方式混合脂质和 RNA 以形成纳米颗粒是成功配制和递送 LNP 的关键。
流速、温度和混合比等关键工艺参数 (CPP) 会影响所得纳米颗粒的理化特性。适当的分析和生物学测定可评估加工变量的变化如何影响纳米颗粒的特性，包括粒度、多分散指数 (PDI) 和药物包封效率 (EE%)，从而指导制剂和工艺开发，以确保在所有开发阶段都能保持产品的同一性、效力和安全性。
传统的纳米颗粒制造方法涉及湍流混合工艺，即含有 LNP 的有机溶剂与 RNA 的水溶液以不受控制的方式混合。然而，粒度不均、封装不一致以及批次间可重复性差等问题阻碍了扩大规模。
开发非湍流微流体混合装置是为了克服湍流生产技术的缺点，提高纳米药物生产的一致性和可重复性。NxGen™ 技术使微流体的流速比传统微流体设计高出数千倍，同时保持受控混合条件，从而使微流体在药物开发和制造中变得可行且实用。非湍流使流体流（包含溶解于有机溶剂中的脂质和溶解于水性缓冲液中的核酸）以受控方式汇聚在一起，产生溶剂极性变化，并触发形成负载 RNA 的 LNP。对化学和物理环境的精确控制可实现高度可预测、时间不变的混合，从而实现可靠、可重复的纳米颗粒自组装。
NxGen™ 技术适用于一系列 NanoAssemblr™ 系统，其通量不断提高，可支持从临床前、临床到商业化生产等所有药物开发阶段的 LNP 制剂，同时还能满足相应阶段的监管要求。由于在小规模临床前仪器上建模的操作可更容易地转换到大规模平台上，因此在不同生产规模下保留的混合元素为开发人员提供了一种基于风险的化学、制造和控制 (CMC) 研究方法。这种可扩展性有助于最大限度地减少技术转让过程中的可变性，并减少 cGMP 生产前的工程运行次数。当然，工艺开发通常并非呈线性，可能需要在不同规模之间移动，以重新审视和优化工艺参数。与静态技术相比，支持这种灵活性的可放大性技术可实现快速、简化的工艺开发。
LNP-RNA 组装后下游工作流程的下一阶段为切向流过滤 (TFF)，包括洗滤和超滤。对于纳米颗粒，洗滤用于将制剂过程中使用的有机溶剂替换为适合储存稳定性和给药的缓冲液。然后，超滤将治疗药物浓缩为最终制剂。
自扩增 RNA-LNP COVID-19 疫苗的开发
saRNA 疫苗能够促进靶细胞内 mRNA 的自我复制，因此被视为下一代 mRNA 疫苗。这种方法的优势在于剂量较低，大大降低了对原材料的需求和生产负担。
2020 年，我们利用 NanoAssemblr™ 生产平台（用于加拿大制造的 COVID-19 saRNA 疫苗）开发了两种 saRNA-LNP 候选疫苗制剂 LNP-1 和 LNP-2。两种制剂在所有生产规模下都保持了相似的 CQA，包括粒度、PDI 和封装效率。但是，LNP-1 体外 表现优于 LNP-2，体内 结果两者相当。
在优化下游 TFF 参数并考虑其对颗粒特性的影响时发现，LNP-1 粒度和 PDI 增加，而 LNP-2 粒度和 PDI 随着规模扩大保持稳定。此外，与 LNP-2 相比，LNP-1 在存储过程中表现出的稳定性不佳。尽管 LNP-1 表现出的生物活性略高，但这一发现强调了在放大过程中优化工艺参数的重要性，并导致选择 LNP-2 作为进一步开发的先导候选疫苗。
如果没有稳定性和可放大性数据，LNP-1 很可能已在研发过程中更进一步。这一具有警示意义的实例强调了在下游工艺开发中进行尽职调查的必要性，以降低扩大规模过程中的失败风险，并防止在商业化道路上出现代价高昂的延误。
垂直可放大性 NanoAssemblr™ 平台大大加速了新型 saRNA COVID-19 疫苗的开发，并提供了从临床前过渡到 cGMP 生产的灵活机制，为开发针对一系列疾病的其他基于 LNP 的纳米药物提供了路线图。LNP-2 先导候选疫苗正在接受进一步评估。
对于任何药物开发人员来说，工艺开发都是一项挑战，mRNA 疫苗的研发也不例外。要实现可持续、经济高效且稳健的生产工作流程，从而确保最终产品的安全性和有效性，就需要进行工艺优化。NanoAssemblr™ 系统等平台技术可在小规模下对单元操作进行建模，用于预测在大规模生产中的表现，从而加速工艺优化。
加快新型 mRNA 疫苗和其他基于 LNP 疗法的开发和商业化进程，有可能确保全球做好应对未来传染病大流行的准备，并更快地为患者带来挽救生命的治疗手段。