在一定程度上得益于针对 SARS-CoV-2 病毒的信使 RNA (mRNA) 疫苗在临床上取得的成功，基于 RNA 的疗法成为一类迅速发展的基因组药物。一些突破性 COVID-19 疫苗所采用的 mRNA 和脂质纳米颗粒 (LNP) 递送技术可以加快开发、生产和应用的速度并提供灵活性，这些关键优势可能会改变我们目前的预防性疫苗研发方法，并为癌症等疾病提供新的治疗方法。
如今 RNA-LNP 疗法受到前所未有的高度关注，对该领域的投资也达到历史新高，从新型个性化疗法，到用于应对大规模疫情且可快速部署的制剂，各类研究项目的数量正在日益增长，需要能够扩大生产的制造工艺。
然而，由于这是一项相对较新的技术，LNP 封装 RNA 的制造商仍面临一些需要克服的障碍。诸多发展过程中的困难让人回想起单克隆抗体 (mAb) 研发的早期阶段，当时该行业面临着滴度低和纯化产量差的困扰，导致商业制造成本高昂且效率低下。工艺开发是克服 mAb 所面临这些挑战的关键，并且也将成为推动 RNA-LNP 疗法发展的关键因素。
对于 RNA-LNP 疗法来说，LNP 封装工艺非常复杂。两种液体流（一种含有溶解于有机溶剂（即乙醇）中的脂质，另一种含有酸性缓冲液中的 RNA）必须在精确控制下混合才能诱导自发组装。微流体混合是配制 LNP 的主要方法，因为该方法可对 LNP 和 RNA 物种进行受控、快速的非湍流混合，同时具有可扩展性和可重复性 (1-4)。
配备 NxGen™ 微流体技术的 NanoAssemblr™ 仪器等支持技术平台可在较宽的流速范围内生产体积从微升到升的 RNA-LNP 批次，以确保无论规模大小皆能实现稳健且可重复的纳米颗粒生产。尤其是，NanoAssemblr™ Ignite™/Ignite+™ 和 Blaze™/Blaze+™ 系统是易于使用的平台，作为质量源于设计 (QbD) 最佳实践的一部分，其有助于在工艺开发过程中采用基于风险、具有成本效益的方法快速探索设计空间。
在 RNA-LNP 配制步骤的下游，有一些针对该类新型疗法独有的关键工艺考虑事项，在工艺开发过程中对其进行全面评估和规模优化非常重要。在此，我们重点介绍整个 RNA-LNP 生产工作流程中的三项重要工艺考虑事项，包括极限尺寸行为、在线稀释和下游切向流过滤 (TFF)（图 1）。
图 1. RNA-LNP 工业化生产的关键单元操作。
RNA-LNP 工艺开发中的极限尺寸表征
工艺开发的一项关键目标是保持关键质量属性 (CQA)，如粒度、多分散性 (PDI) 和形态，同时随着规模扩大，总流速 (TFR) 等关键工艺参数 (CPP) 也会增加，以实现更高的通量。
极限尺寸定义为特定 LNP 组成和 RNA 有效载荷可实现的最小纳米颗粒尺寸，是 RNA-LNP 制剂的一个参数，受微流体工艺参数 (5-7) 的影响，通常为 40 至 120 nm 之间。在新 RNA-LNP 制剂工艺开发过程中，一项基本工作是表征相对于混合流速的纳米颗粒尺寸分布，以构建极限尺寸曲线。一旦达到足够高的流速，再增加流速也不会改变粒度。从理论上讲，这意味着在超过最小极限尺寸流速下操作应能产生相同尺寸的 RNA-LNP 颗粒 (7)。这种极限尺寸信息有助于选择流速、定义操作极限和优化通量，从而生产出具有一致 CQA 的纳米颗粒，并能承受微小的 CPP 波动。
这款新型台式 NanoAssemblr™ Ignite+™ 系统配备了 NxGen™ 和 NxGen 500 微流体混合器，可以方便地以代表大规模生产的流速对新型 RNA-LNP 候选药物进行极限尺寸表征实验。通过使用简单的台式工作流程和小体积 (<10 mL) 样本，执行极限尺寸表征既快速又经济。通过更高流速（高达 200 mL/min）和更大容量（高达 60 mL）扩展 NanoAssemblr™ Ignite™ 系统的能力，可实现按需生产制剂，从而支持快速、经济高效的工艺开发。
在确定了极限尺寸行为之后，这些研究结果将被应用于更大规模的仪器，例如 NanoAssemblr™ Blaze™/Blaze+™（高达 115 mL/min 和 10 L）系统。与传统的临床系统相比，使用 NanoAssemblr™ Blaze+™ 系统可让用户在更短的时间内以更低成本的系统大规模制备制剂，从而降低工艺开发成本并加快时间进度。在此规模下生产的材料可支持对先导 RNA-LNP 候选药物进行进一步的分析表征、启动制剂稳定性研究、评估包括 TFF 在内的上游和下游程序，同时可在临床前评估期间进行更大规模的体内动物研究 (7)。
在线稀释为 LNP 稳定性提供了一致的可放大性选项
经过初始 RNA-LNP 配制步骤后，乙醇百分比通常为总体积的 20% 至 33%。该浓度会阻止纳米颗粒形成稳定状态，如果将 LNP 长时间置于高溶剂环境中，则容易降解。因此，配制后需要进行稀释和下游纯化，以去除和交换有机溶剂。及时稀释配制好的 LNP 是保证颗粒稳定性的必要条件，尤其是大批量时，因为配制过程所需的时间会增加。
通常在研究规模下，通过手动移液或将制剂倒入稀释缓冲液中进行批量稀释来完成稀释过程。然而，在临床规模下，该方法既不实用，也无法放大。NanoAssemblr™ Ignite+™, Blaze™/Blaze+™ 和 GMP 系统的选项融入了配制后在线稀释，各系统均有稀释滤器可供选择。此外，与手动或批量稀释相比，在线稀释以相同的比例稀释体积，因此可确保一致性。
可在 NanoAssemblr™ Ignite+™/Ignite+™ 系统上对在线稀释与批量稀释进行初步可行性分析，然后转到 NanoAssemblr™ Blaze™/Blaze+™ 系统上进行更大规模的研究。由于 NanoAssemblr™ Blaze™/Blaze+™ 系统能够进行与临床规模 GMP 系统类似的更长时间大规模运行，因此它们能为长时间配制后的制剂稳定性和颗粒行为提供有价值的见解。通常情况下，需要稀释到 30:1 才能评估制剂的长期稳定性。
在临床前开发过期间，以临床相关流速建立在线稀释模型有利，这样可以经济、实时的发现潜在稀释敏感性和先导 LNP 候选药物的稳定性问题。在工艺开发早期采取这一步骤有助于减少后期可能出现的挫折。随后，可以在 NanoAssemblr™Blaze™/Blaze+™ 系统上更大规模地验证在线稀释参数和稳定性研究，以便最终转移到 GMP 系统。
RNA-LNP 下游纯化考虑事项
在线稀释后，使用超滤/洗滤 (UF/DF) 方法去除残留溶剂，并将 RNA-LNP 药品浓缩为所需缓冲液中的最终制剂。LNP 制剂可能对剪切敏感，因此需要仔细优化过滤单元操作，以实现高通量和高产能，同时保持纳米颗粒的尺寸和形态以及与其生物分布和体内功能有着内在联系的物理化学特性 (8)。
切向流 (TFF) 过滤是用于 UF/DF 的可放大性方法，但在可放大规模过程中从透析和离心过滤等可放性较差的净化方法迁移并非没有成本和风险。过滤芯类型、膜材料、剪切速率、截留分子量 (MWCO) 和跨膜压 (TMP) 等 TFF 工艺的 CPP 都必须进行适当表征，以防止对纳米颗粒的尺寸和形态发生不必要的改变 (4,8)。
不同规模的 TFF 各不相同，并非所有 RNA-LNP 制剂都与 TFF 系统固有兼容，这一点在早期临床前开发期间需要考虑，因为这会影响 RNA-LNP 候选药物的可制造性。这种见解可能有助于在开发过程中选择先导候选药物。在 NanoAssemblr™ Ignite+™ 系统上以较小规模进行的 TFF 研究可轻松过渡至 NanoAssemblr™ Blaze™/Blaze+™ 仪器，以扩大过滤器尺寸和泵送系统。此外，更大批量对于生成更大/长期稳定性研究的特定数据以及了解临床规模下的工艺流程非常重要。
蛋白质疗法生物制造的当前趋势是通过采用一次性使用技术、封闭系统和连续加工来建立更加灵活的多产品设施。这一转变也适用于纳米药物生产，由于 RNA 和 LNP 技术都具有模块化特性，这为产品无关性生产平台提供了机会。可以在 NanoAssemblr™ Blaze+™ 系统上进行研究，评估封闭系统环境下的生产工艺，包括耗材（即生物工艺袋）和单元操作。
随着行业发展势头将这些新模式推向主流，建立健全的生产工艺对于充分释放基因组药物的潜力至关重要。垂直应用可放大性生产平台从 NanoAssemblr™ Ignite™/Ignite+™ 系统转向 NanoAssemblr™ Blaze™/Blaze+™ 系统，对于定义和优化下游参数（如极限尺寸、在线稀释和 TFF）同时支持快速且经济高效的临床前工艺开发具有不可估量的价值。
NanoAssemblr™ Ignite™/Ignite+™ 系统首先可用于有效确定可放大性工艺（如在线稀释）与小规模给定制剂手动工艺相比的可行性。初步结果可以转移并适应 NanoAssemblr™ Blaze™/Blaze+™ 系统，以评估规模化工艺参数（可预测临床用量），从而降低技术转移到 cGMP 生产的风险。此外，NanoAssemblr™ 仪器套件采用一次性使用组件，可快速适应工艺开发变化。
随着行业不断发展，这些技术工具对于在工艺开发阶段获得广泛的工艺知识、加快时间进度、提供直接的临床开发途径以及最终获得市场批准和商业化生产至关重要。
参考文献
1. Daniel S, Kis Z, Kontoravdi C, Shah N. Quality by Design for enabling RNA platform production processes [published online ahead of print, 2022 Apr 28]. Trends Biotechnol. 2022;S0167-7799(22)00080-4. doi:10.1016/j.tibtech.2022.03.012
2. Reichmuth AM, Oberli MA, Jaklenec A, Langer R, Blankschtein D. mRNA vaccine delivery using lipid nanoparticles [published correction appears in Ther Deliv. 2016 Jun;7(6):411]. Ther Deliv. 2016;7(5):319-334. doi:10.4155/tde-2016-0006
3. Whitley J, Zwolinski C, Denis C, et al. Development of mRNA manufacturing for vaccines and therapeutics: mRNA platform requirements and development of a scalable production process to support early phase clinical trials. Transl Res. 2022;242:38-55. doi:10.1016/j.trsl.2021.11.009
4. Roces CB, Lou G, Jain N, et al. Manufacturing Considerations for the Development of Lipid Nanoparticles Using Microfluidics. Pharmaceutics. 2020;12(11):1095. Published 2020 Nov 15. doi:10.3390/pharmaceutics12111095
5. Belliveau NM, Huft J, Lin PJ, et al. Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 2012;1(8):e37. Published 2012 Aug 14. doi:10.1038/mtna.2012.28
6. Zhigaltsev IV, Belliveau N, Hafez I, et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 2012;28(7):3633-3640. doi:10.1021/la204833h
7. Precision NanoSystems. Application Note: Developing a Scalable RNA-LNP Drug Product for Clinical Translation. Document ID: ignite+-AN-0622
8. Precision NanoSystems. Accelerating The Development And Scale-Up Of mRNA Vaccines. Cell & Gene. Published March 2, 2022. https://www.cellandgene.com/doc/accelerating-the-development-and-scale-up-of-mrna-vaccines-0001 Accessed August 9, 2022.