荧光成像是一种多功能且灵敏的方法，可用于对化石和矿物进行无损检测。所有矿物均具有独特的光学特性，通过使用不同光源与滤光片组合拍摄多幅荧光图像，可快速识别出肉眼难以察觉的相似或相异的表层结构。我们将展示荧光技术的新进展如何应用于化石表征。
简介
地球生命演化的物理证据以化石的形式保存在矿物和岩石中。化石形态各异，有从骨骼到有机物质的印迹。对化石及其发现地点的仔细考察有助于确定化石的年龄和环境。许多科学方法可用于分析化石，其中包括：
- 光学显微镜：观察微观细节
- 电子显微镜：以高分辨率观察细节
- 振动光谱技术：绘制表面化学成分图
- X 线和 CT 扫描：研究内部结构
- 同位素分析：研究饮食和栖息地
- 放射性定年法：测定年代
- 放射性定年法：测定年代
- 荧光成像
荧光成像技术近年取得显著进展，新型光源（覆盖紫外至近红外 (NIR) 波段）与发射滤光片的开发，为多种样本类型的探索开辟了新途径。我们展示了如何利用两种成像系统Amersham™ ImageQuant™ 800 成像系统和Amersham™ Typhoon™ 激光扫描仪对化石样本进行研究（图 1）。这两种仪器均非常适用于对多种标本进行荧光分析。
图 1. 我们使用 Amersham™ ImageQuant™ 800 成像系统和 Amersham™ Typhoon™ 扫描仪对化石进行成像，揭示了有关标本的新信息。
由于化石的脆弱性，通常需要进行一些保存处理。清洁、粘合以及有时使用保护性涂层进行稳定化处理有助于保存，但可能使表面分析复杂化。此外，人工修复或伪造化石案例时有发生。对于这些情况，荧光成像是一种有助于区分化石与其他人造材料的有用方法 (1)。
荧光成像是一个快速发展的领域，目前有许多不同的选项可供选择。Amersham™ ImageQuant™ 800 成像系统允支持多种激发光 (LED) 与带通发射滤光片组合。内置六种激发 LED 光源，覆盖紫外 (365 nm) 至近红外 (775 nm) 的光谱范围。工作区域 (16 × 22 cm) 可用于研究小型至中型化石。此外，高效的光收集能力可实现大景深的数值孔径。因此，非平整物体非常适合使用 Amersham™ ImageQuant™ 800 成像系统进行研究。而对于高度 < 2="" cm="" 的平整样本，可使用="" amersham™="" typhoon™="" 激光扫描仪。amersham™="" typhoon™="" 激光扫描仪还具有="" 40="" ×="" 46="" cm="" 的大扫描面积，并能实现像素尺寸低于="" 100="" 微米的高分辨率（表="" />
表 1. 化石成像设备比较
| Amersham™ ImageQuant™ 800 成像系统 | Amersham™ Typhoon™ 激光扫描仪 | |
| 扫描区域 | 16 × 22 cm | 40 × 46 cm |
| 样本要求 | • 从样本上方收集光线 • 非平整样本可通过约 2 cm 的荧光景深进行成像 |
• 平整样本面向扫描仪玻璃板 • 最大物理样本高度：2 cm |
| 光源 | LED：365、460、535、635、660、775 nm + 白光源 | 激光：488、532、635、685、785 nm |
| 探测器 | 830 万像素冷却 CCD | 高动态范围 PMT |
| 输出文件 | 16 位分析文件，加彩色图像 | 16 位分析文件，无白光彩色图像 |
结果和讨论
所研究的化石概述
化石标本由瑞典乌普萨拉大学进化博物馆借出。所选择的化石涵盖不同地质时期的多种化石类型。最年轻的化石是包裹于琥珀中的双翅目昆虫化石，来自 3400 万至 5600 万年前的始新世，最古老的化石来自寒武纪。我们研究的化石列表见表 2。
表 2. 本研究中考察的化石来自多个地点且来自不同时期（所有化石标本均由瑞典乌普萨拉大学进化博物馆借出。）
| 标本 | 描述 | 图号 |
| 双翅目昆虫 | 波罗的海地区包裹于琥珀的昆虫 | 3 |
| 星口似水母 | 中国澄江地区寒武纪时期神秘化石 | 4 |
| 栉虫目 | 瑞典东约特兰地区奥陶纪三叶虫 | 5 |
| 脉羊齿 | 来自德国的石炭纪蕨类植物 | 6 |
| 混鱼龙 | 来自斯瓦尔巴特的三叠纪鱼龙类海洋爬行动物 | 7 |
| 肿肋龙 | 来自意大利的三叠纪蜥鳍类海洋爬行动物 | 8 |
| 贵州龙 | 来自中国的三叠纪蜥鳍类海洋爬行动物 | 9 |
图 2. 本研究中考察的时间线和不同化石用绿色箭头表示。当前地质时代跨越 5.41 亿年，始于寒武纪时期，当时动物首次进化出坚硬外壳，这些外壳能够在化石记录中保存下来。
近红外荧光 (NIR) 揭示了新细节
由于许多材料不吸收近红外光，因此近红外荧光对背景的敏感度较低。这可用于解析样本中更深层次的特征，例如用于生物医学和组织检查。这一特性对研究化石也具有实用价值。
我们首先研究的化石是来自波罗的海地区的双翅目昆虫，其包裹于琥珀中（图 3）。在可见光激发下未观察到昆虫的信号，但通过 NIR 激发可轻松检测到昆虫的自发荧光。由于琥珀表面不平整，昆虫的实际形状在图像中出现变形。这表明 NIR 荧光是一种很有前景、适用于研究半透明琥珀包裹物体的方法。
图 3. 来自波罗的海地区含昆虫（双翅目）抛光琥珀的图像。可见荧光激发（532 nm；570BP20）下无法检测到昆虫包体，但使用 Amersham™ Typhoon™ 激光扫描仪在 NIR 激发（785 nm；825BP30）下可清晰检测到。琥珀的曲面导致部分图像畸变。黑色比例尺为 1 cm。灰度图像的对比度范围从白色（低强度）到黑色（高强度）。
接下来，我们研究了寒武纪时期的星口似水母化石。这是我们研究过的最古老化石，当使用 Amersham™ ImageQuant™ 800 成像系统对其进行成像时，它在近红外光谱区域表现出强烈的自发荧光（图 4）。
图 4. 中国澄江星口似水母化石（寒武纪）的白光（左）和荧光图像（右上）。使用 Amersham™ ImageQuant™ 800 成像系统在近红外激发 (775 nm) 下对化石进行成像。比例尺为 1 cm。3D 视图（右下）有助于直观评估整个表面的信号分布。
我们还研究了栉虫目三叶虫，以考察具有非平坦拓扑结构的标本。我们在三叶虫头部发现了荧光发射的差异性证据，这表明化学成分存在一些差异（图 5）。
图 5. 瑞典纳尔克地区三叶虫（奥陶纪膨大栉虫）的白光和荧光多色图像。使用 Amersham™ ImageQuant™ 800 成像系统不同光线和滤光片组合对化石的不同部位及层位进行了观察。NIR 激发荧光 (775 nm) 在三叶虫双眼之间的某些部位存在差异，如箭头所示。白色比例尺为 1 cm。
使用紫外照明和 NIR 带通滤光片测得非常大的斯托克斯位移
在极端条件下被岩石长期挤压时，有机物质通常会转化为薄碳膜。这类化石非常适合非接触式荧光成像。我们研究了石炭纪时期的蕨类化石（图 6）。我们观察到荧光发射有非常大的斯托克斯位移。该蕨类化石在 365 nm 紫外 LED 照射下，通过带通滤光片检测到约 840 nm 的荧光发射，对应的斯托克斯位移接近 500 nm。需要进一步研究以了解化石由哪种碳组成，这通常通过振动光谱法完成。
图 6. 脉羊齿碳膜化石（德国）的白光和荧光图像。使用 Amersham™ ImageQuant™ 800 成像系统，在 365 nm 紫外光激发下，通过带通滤光片在 525 nm（中间图像）和 836 nm（右侧图像）下采集图像，以展示如何通过不同光和滤光片组合观察化石的不同层。灰度图像的对比度范围从最弱强度的白色到黑色。比例尺为 1 cm。
轻松进行区域比较
荧光成像极为有用的一项功能是能够轻松比较不同区域。大多数材料会发出自发荧光，且相似材料发出的光强度也相似。尤其是在颜色叠加图像中比较多幅图像时，很容易识别出化学成分相似的区域。其中一个例子是在斯瓦尔巴群岛发现的混鱼龙化石（图 7）。化石颜色叠加图像中的绿色和紫色区域表明化学成分存在差异。右上角还有一个区域可能来自不同的化石。
图 7. 使用 Amersham™ ImageQuant™ 800 成像系统拍摄的 Phalarodon Nordeskioldii（三叠纪中期，拉丁期，“海生爬行动物层”，Botneheia 组，斯匹次卑尔根岛）部分头骨的白光与荧光叠加图像。不同激发光与带通滤光片组合揭示了化石中相似物质层。例如，牙齿轮廓呈现出强烈的荧光信号，以紫色标注。白色比例尺为 20 mm。
使用 Amersham™ Typhoon™ 激光扫描仪显示更细微的细节
Amersham™ Typhoon™ 激光扫描仪可用于对平整且厚度不超过 2 cm 的化石进行成像。Amersham™ Typhoon™ 激光扫描仪因其光学设计，可提供更高分辨率和更精准的激发。建议在化石周围放置保护垫，以保护化石和扫描仪。图 8 中保存完好的标本以每像素 10 µm 的分辨率进行扫描。这些高分辨率图像中丰富的信息量，实现了对该标本的解剖结构进行亚毫米级别的详细研究。
图 8. 意大利贝萨诺组的 Pachylpeurosaurus staubi 化石（三叠纪中期）在所有荧光通道中均显示出强荧光信号。灰度图像的对比度范围从黑色（弱强度）到白色（最强强度）。图像使用 Amersham™ Typhoon™ 激光扫描仪捕获，其使用 488 nm 激光，像素大小为 10 µm。比例尺为 1 cm。
最后，随着人们对化石的商业兴趣日益增加，人工改进化石甚至伪造化石的情况也愈发常见。对化石进行如此详细的研究以确定是否存在此类情况可能耗时较长。荧光成像可快速筛选真实性。具体来说，基于对类似化石的研究而预期的自发荧光水平可作为第一标准。荧光强度的细节水平和分布也是有用的质量指标。图 9 显示了一个需要进一步研究的化石示例。该化石可能是三叠纪蜥鳍类海洋爬行动物化石，但与图 8 中的化石相比，其细节不够精细，且所有通道的自发荧光均较弱。
图 9. 在 Amersham™ Typhoon™ 激光扫描仪下贵州龙显示微弱且弥散的荧光信号。灰度图像的对比度范围从最弱强度的白色到黑色。白色比例尺为 1 cm。
结论
我们已证明，现代成像系统（例如 Amersham™ ImageQuant™ 800 成像系统和 Amersham™ Typhoon™激光扫描仪）可用于化石表征。现代成像仪在光源和光收集滤光片方面提供了多种选择。
- NIR 区域内某些物质的自发荧光可以让你更深入地观察物质，例如琥珀和三叶虫。
- 在碳膜研究中，可利用具有极大斯托克斯位移的紫外激发与发射研究非晶碳相。
- 荧光成像还可快速比较不同表面层。
- 最后，Amersham™ Typhoon™ 激光扫描仪可对保存完好的标本进行精细细节的仔细观察。
参考文献
- Selden PA, Olcott AN, Downen MR, Ren D, Shih C, Xiaodong C. The supposed giant spider Mongolarachne chaoyangensis, from the Cretaceous Yixian Formation of China, is a crayfish, Palaeoentomology. 2019;2(5):515-522.