分子即时检测 (POC) 技术正迅速发展，使诊断更加快速和便捷。了解更多所使用的新兴技术及样本制备技术，这些技术对于确保成功至关重要。
从实验室检测转向 POC 检测
分子 POC。当您听到这个术语时，可能会联想到在患者床边进行的一项具有灵敏度和特异性的检测。该检测可加速临床决策并改善患者预后。但是，在这些积极的设想中，诸如“复杂”、“耗时”或“技术性强”等词汇也可能浮现在脑海中。确实，这些缺点曾是将分子诊断从实验室检测转向床边检测的障碍。
然而，得益于最近的进展，用于检测核酸疾病生物标志物的分子检测现在正被应用于实验室以外的环境。这些进展包括对扩增技术和微流控技术的创新使用，以及对液体活检和冻干等样本和试剂制备的改进。
新兴分子 POC 技术
将分子诊断技术应用于 POC 检测并非易事，需要提高实验室技术的速度、便携性和简单性；同时保持高灵敏度和特异性。
POC 检测的一项关键突破在于利用微流控技术创建“芯片实验室”POC 检测。这些检测在微流控通道内完成所有样本、分析和检测反应。因此，芯片实验室检测体积小、便于携带，且所需样本和试剂很少。它们能大幅降低成本和检测周期，并可实现多种分析物的检测。
多种诊断技术已成功用于分子 POC 检测，包括聚合酶链式反应 (PCR)、等温扩增技术和 CRISPR。
更快、更便携的 PCR 检测
PCR，尤其是逆转录 PCR (RT-PCR) 和实时 PCR（qPCR）是分子诊断的金标准技术。这些技术极其灵敏，能够扩增单个 DNA 或 RNA 分子并产生检测信号。
采用微流控技术的几种 RT-PCR 系统（包括Cepheid GeneXpert）已获得美国食品药品监督管理局 (FDA) 的临床实验室改进修正案 (CLIA) 豁免，允许其在 POC 环境中使用。这些系统通常使用单个检测盒，其中包含用于样本制备、扩增和检测的独立腔室。
这些微流控系统采用的小反应体积极大缩短了热循环所需时间，可在 30 分钟内获得检测结果。到目前为止，GeneXpert 系统已被用于多种检测，包括 COVID-19、甲流和乙流联检，以及数种人乳头瘤病毒 (HPV) 癌型的联检(1-3)。
随着微流控技术及其他检测组件的进展，我们有望看到基于 PCR 的 POC 检测速度进一步提升（图 1）。
图 1.搭载微流控芯片的 PCR 系统设计
使用等温扩增进行快速简便的 POC 检测
等温扩增技术相较于 PCR，可能更适合 POC 检测，其特点是成本低廉、单管检测且无需热循环步骤。环介导等温扩增 (LAMP) 和重组酶聚合酶扩增 (RPA) 是分子 POC 检测中非常常用的两种等温扩增技术。
基于 LAMP 的设备
近年来，具有逆转录步骤的几种 LAMP 系统 (RT-LAMP) 在 POC 环境中的应用日益普及。这些系统为台式平台，提供检测多种传染病的试剂盒。用户只需按照说明将患者样本与试剂盒试剂混合，将试管放入机器进行扩增，即可在不到一小时内获得结果。这些检测甚至无需从样本中提取核酸即可进行。只需 30 分钟即可诊断的疾病包括疟疾、A 型链球菌和 B 型链球菌、HPV、百日咳和性传播感染 (4，5)。
LAMP-on-a-chip 系统的开发进一步提升了 LAMP 检测的速度和可及性（图 2）。这些设备可以在短短 15 分钟内检测出多种 HPV 类型，甚至可用于在短短 3 分钟内检测 COVID-19，这是截至 2023 年报告的最快 COVID-19 检测 (6，7)。
图 2.LAMP 与微流控集成的关键步骤和组件
集成 RPA 的侧向层析检测
RPA 是另一种用于 POC 检测的快速发展的分子诊断技术（图 3）。其主要优势在于等温扩增温度低，为 37°C 至 42°C，甚至可在室温下进行扩增。
RPA 的另一优势在于，标记的扩增产物可通过侧向层析试纸条轻松检测。因此，您既能享受侧向层析检测的好处（包括其低成本、简单组件和快速开发），又能获得 RPA 的高准确性和快速周转时间。
RPA 侧向层析检测已用于检测多种传染病，例如 COVID-19、沙门氏菌、热带病曼氏血吸虫检测，以及登革热病毒血清型的联检 (8-10)。
图 3.(A) 示意图：展示 RPA 与 LFD 的融合，以 FAM（羧基荧光素）标记。(B) 结构示意图：概述 LFD 的结构，包括检测线和对照线。(C) 结果：描述阳性和阴性结果。
等温扩增与 CRISPR 结合
尽管基于等温扩增的 POC 检测具有诸多优势，但其主要缺点是存在非特异性扩增的风险，这可能导致假阳性结果。为克服这一问题，科学家正开发将等温扩增与高精度基因编辑技术 CRISPR 相结合的 POC 检测。
在这些检测中，DNA 首先通过等温扩增进行扩增，随后使用 CRISPR/Cas 系统进行检测。整个过程都在单一试管内完成。已开发出多种 CRISPR-等温 POC 检测，包括用于检测 COVID-19、疟疾和非洲猪瘟的检测。这些检测表现出高性能，部分甚至达到 100% 的特异性和敏感性 (11-13)。
样本和试剂制备的力量
分子诊断从实验室向 POC 转变得益于样本和试剂制备步骤的进步。为简化和增强细胞及核酸分离、纯化和试剂稳定性，已开发出多种技术。这些技术包括液基细胞学、液体活检以及使用真孔膜（例如径迹刻蚀膜、氧化铝膜）和冻干试剂。
用于癌症诊断的液基细胞学和液体活检
液基细胞学已成为癌症诊断的一种创新样本制备技术。制备过程中，在液体培养基中悬浮和固定细胞，同时去除任何细胞碎片和污染物。采用单层涂片制备技术制备细胞供显微镜分析，这是一种有效的一线癌症诊断方法，通常在分子检测前使用。
采用液体基细胞学制备的细胞样本也可用于下游分子 POC 检测 (14)。然而，必须首先去除所使用的固定剂（例如福尔马林和甲醛），以防止其干扰诊断检测。
另一项正在革新癌症诊断的样本制备技术是液体活检。该过程需要分离肿瘤衍生物质，包括循环肿瘤细胞、循环肿瘤 DNA 以及来自血液或其他体液的细胞外囊泡。液体活检是传统组织活检的便捷、快速且无创替代方法。其仅需极少量样本，可用于开发 POC 癌症诊断。
径迹刻蚀膜
基于膜的 POC 设备因其速度快、坚固耐用、价格实惠、易于使用和可扩展性而在分子诊断中应用日益广泛。然而，其性能高度依赖于所用材料的选择。样本制备用膜是极为重要的组件之一，负责分离和纯化目标分析物。
径迹刻蚀膜 (TEM) 是分子 POC 检测中样本制备的最佳选择之一。TEM 由高品质聚碳酸酯 (PC) 或聚对苯二甲酸乙二醇酯 (PET) 薄膜制成，具有高流速、出色的耐化学性和耐热性以及明确的孔径尺寸。
其受控的孔径可实现目标分析物与任何杂质或抑制剂的精准分离。当集成到 POC 检测中时，TEM 膜可提供快速且高效的样本过滤，且分析物损失极少。
冻干试剂
分子诊断从实验室转向 POC 所面临的一个障碍是所用试剂的稳定性。许多试剂在室温下不稳定，需要储存在 -80°C 的冷冻箱中。这种温度要求限制了 POC 环境中分子检测的运输和储存选项。
试剂稳定性问题可通过冻干（也称为冷冻干燥）来解决。该过程降低了试剂中的水含量，使其在室温下反应性更低、更稳定。使用冻干试剂的 POC 检测试剂盒更易于储存和运输。此外，单剂量试剂可在试剂颗粒的单试管内组合，因此简化了分子 POC 检测流程。
分子 POC 检测的光明前景
分子诊断技术从实验室走向患者床边，标志着医疗保健领域的重要里程碑。将这些技术整合到POC设备中，使便携式、超快速诊断检测在广泛的应用领域得以开发。
展望未来，POC 检测开发的持续进步预计将进一步提升诊断检测的速度、性能和应用，涵盖传染病到肿瘤学及更广泛领域。
随着 POC 检测的发展，Cytiva 可以帮助您将复杂的诊断概念转化为可靠的 POC 检测。我们提供广泛的定制诊断服务，可帮助您加速分子诊断检测从构思到商业化的开发。
参考文献
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