定量 Western 印迹的最佳实践
Western 印迹现已成为生命科学研究和医学诊断实验室中普遍使用的常规技术，大约在40年前首次被描述为一种定性蛋白质分析方法。1,2早期 Western 印迹方案操作繁琐，需要对蛋白质进行放射性标记才能检测，这给原本常规的检测增加了危险因素。可以理解的是，这推动了人们开发安全性更高、灵活性更强、检测灵敏度更高的非放射性替代品。尽管定性 Western 印迹是一种可靠而广泛的蛋白质检测方法，但由于其无法准确量化蛋白质表达的变化，因而受到限制。
为了解决定性 Western 印迹法的缺点而做出的努力不仅简化了定性方法，还将 Western 印迹法作为一种定量工具加以推广。
在 Western 印迹法中，蛋白质通常表现为阶梯状条带，其中观察到的每条条带密度与蛋白质丰度成正比例关系。但是，要确定特定蛋白质丰度的比率变化，需要一个信号发射标签（最好通过数字成像进行可视化和分析）。这种更高成像灵敏度的先决条件是定量 Western 印迹的特点，也是克服传统定性方法固有局限性所必需的附加程序步骤。
定性信息可能足以满足概念验证研究的需要，在这类研究中，实验目标是确定蛋白质存在与否。但是，定量 Western 印迹法已成为可靠说明特定蛋白质参与生理反应或疾病病理过程的必要方法。定量 Western 印迹法以相对或绝对的方式确定蛋白质的存在量，其中蛋白质丰度根据条带强度确定，并通过化学发光或荧光这两种主要检测类别来分辨。
相对定量取决于基线参照物的正确选择，基线参照物通常是管家蛋白或总转移蛋白。通过获取已知量的纯化蛋白质的信号值，并根据已知量蛋白质的系列稀释液生成标准曲线（例如，牛血清白蛋白），可以确定特定目标蛋白质的绝对丰度。3绝对定量和相对定量方法都力求实现同一目标：精确测量蛋白质丰度的变化。
管家蛋白是指在实验细胞或组织模型中通常和组成性表达的蛋白（例如肌动蛋白、微管蛋白、GAPDH）。4这些蛋白通常不受实验操作的影响，因此常用作相对蛋白定量的 Western 印迹负载对照物。它们的发射信号被解释为与相应凝胶泳道中加载的蛋白质量成正比，并用于确定目的蛋白的倍数变化。但是，该方法需要两个基本假设：1) 在所有实验条件下管家蛋白的数量相等；2) 管家蛋白与目的蛋白的检测谱呈线性关系。3 换句话说，这种方法通常被认为最多只能可靠地确认所有含样品泳道的蛋白质加载是否成功以及体积是否相等。
另外，总蛋白染色已成为一种重要蛋白归一化方法，既可验证蛋白质的加载量，也可验证从凝胶到膜的转移效率。这种相对定量方法使用各种市售的基于染色或无染色的方法标记凝胶或膜上的所有蛋白质，然后通过选择几条条带或包含梯状条带的整条泳道进行密度测定分析来定量蛋白质丰度。3,5总蛋白染色法的优点是不需要抗体进行定量，因此不受实验操作的影响。此外，由于总蛋白染色还可验证蛋白质转移效率，因此可作为内部故障排除对照物。
有些研究应用需要对目标蛋白质进行绝对定量而非相对定量。要获得蛋白质绝对质量的测量值，需要适当的纯化蛋白质标准品，这些标准品已与已知质量的纯化蛋白质（例如牛血清白蛋白）进行了比较和校准。3标准曲线可利用多个蛋白质浓度的密度测定数据生成，从而将条带与代表已知数量目标纯化蛋白质的条带进行绝对比较。虽然绝对定量是一种高度精确的方法，有可能对蛋白质功能和细胞信号传导过程产生新的见解，但该方法比较耗时，可能会降低传统学术实验室的工作效率。
无论您采用哪种定量方法（相对或绝对），密度测定分析的主要途径均相同；基本上由传统的定性 Western 印迹方案组成，目的蛋白的信号发射标记为最后一步。纵观自该技术诞生以来发表的无数 Western 印迹，我们可以发现检测方法的演变过程，即化学发光和荧光依赖性标记比放射性蛋白质标记更受青睐。化学发光是一种间接蛋白质检测方法，依赖于二抗与酶（通常为辣根过氧化物酶 (HRP)）的结合。加入含有过氧化氢的增强试剂后，鲁米诺被氧化，产生瞬态光子，从而通过胶片或数字成像进行检测。2顾名思义，荧光是利用荧光染料作为二抗标记，通过配备激发和发射滤光片组合的成像工作站检测目的蛋白。
荧光标记无需使用含过氧化氢的底物来产生可检测的光信号。此外，与化学发光信号不同，荧光产生的发射信号并非瞬态，如果保存得当，不会随时间推移而消失。这些程序优势不仅简化了数据采集过程，还为检测和分析提供了更直接、稳定和一致的选择。此外，多路复用是指同时检测多种蛋白质的能力，只需一抗来自不同物种，相应的（二抗）荧光染料在基于波长的检测光谱上易于区分即可。多路复用分析可以同时观察到不断增加的荧光染料数量，这也是荧光标记比化学发光更省时的优势所在。相比之下，使用 HRP 偶联化学发光二抗检测和定量多种蛋白质的唯一方法是通过一系列费力的膜剥离和重新探测步骤，使用一抗逐一靶向作用于每个目标蛋白质。因此，这种方法在时间和可重复性方面的限制显而易见。简而言之，通过荧光标记进行多路复用可加速得出结果的时间，并简化从定性到定量 Western 印迹的飞跃，否则这一过程可能被视为繁琐且涉及多方面。
要为蛋白质定量目的而选择合适的成像方法，应考虑以下因素：检测系统对发射信号类型的灵敏度、检测范围、信号持续时间和相关背景噪声以及多路复用潜力。需要注意的是，使用荧光进行检测和定量取决于是否有配备合适光源、激发和发射滤光片的专用数字工作站。此外，对于有意通过化学发光进行定性或定量 Western 印迹的研究人员来说，转移膜材料可能不是主要关注点，但要注意的是，如果使用基于荧光的蛋白质定量，硝酸纤维素和聚偏二氟乙烯 (PVDF) 也并非没有缺陷。为了最大限度地减少传统膜材料产生的自发荧光背景噪声，市售的定制低荧光膜可用于基于荧光的蛋白质检测研究。您对归一化、染色和 Western 印迹方案的选择将取决于所需的检测和定量精度水平，以及可用于检测和分析的实验室资源。
定量 Western 印迹技术有助于准确描述蛋白质的生化属性，因而也有助于准确描述正常和疾病生理学中重要的上游细胞信号传导过程。因此，蛋白质表达的定量分析正迅速成为许多同行评审科学期刊发表论文的标准要求，目的是提高其他研究人员的数据可重复性。例如，测量蛋白质丰度对于多蛋白复合物三维结构的精确建模和蛋白质磷酸化化学计量至关重要，这两者都与一系列生物通路有关。此外，如果进行定量分析，则可以更准确地比较抗体结合亲和力，对人类血清抗体滴度进行各种初步分析及其他应用也是如此。了解适当的标准、试剂和方法以及可用的信号检测成像技术是正确定量蛋白质和获得可重复数据的关键。
参考文献
1. Renart J et al., “Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure,” PNAS 76:3116-3120, 1979.
2. Towbin H et al., “Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications,” PNAS 76:4350-4354, 1979.
3. James K, “An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting,” Sci Signal 8:rS2-rS11, 2015.
4. McDonough AA et al., “Considerations when quantitating protein abundance by immunoblot,” Am J Cell Physiol 308:C426-C433, 2015.
5. Posch A, Taylor CS, “The design of a quantitative western blot experiment,” Biomed Res Intl 2014:361590, 2014.