对于您的层析系统来说，拥有准确的流速非常重要，可确保在不同规模下获得可重复的结果。流速准确性在形成梯度时也很重要。在本应用说明中，我们根据流速精度计算了梯度精度和范围。我们还在不同流速下使用流速反馈和电导率反馈运行了阶跃梯度和线性梯度，评估了梯度精度。
ÄKTA process™ 的流速精度为 ±1.0% RD。使用流速反馈时，梯度精度在梯度接受范围 (% B) 内为 ± 1% B。当使用电导率反馈时，梯度精度在梯度接受范围 (% B) 内为 ± 2% B。不同流速下的梯度接受范围见图 5 至 7。
简介
图 1.ÄKTA process™ 层析系统
ÄKTA process™是一款自动化大规模层析系统，提供三种不同的流速范围。流路可采用电抛光不锈钢或聚丙烯工艺管道。该系统可配备两台高性能膜泵。这些泵可在系统允许的所有流速和压力下生成准确且可重复的二元梯度。最大流速和最大操作压力如表 1 所示。ÄKTA process™ 层析系统还可选配第三台泵，以支持在线稀释 (ILD)。
表 1.ÄKTA process™ 系统的最大流速和最大操作压力
| 管道尺寸 | 流速 (L/h) |
最大压力 (bar*) |
|---|---|---|
| 6 mm polypropylene | 1至180 |
6 |
| 10 mm 聚丙烯 |
3至600 |
6 |
| 1 in. 聚丙烯 |
10至2000 |
6 |
| 3/8 英寸不锈钢 |
1至180 |
10 |
| 1/2 英寸不锈钢 |
3至600 |
10 |
| 1 英寸不锈钢 |
10至2000 |
6 |
*1 bar = 0.1 MPa = 14.5 psi
流速精度的定义
流速精度可以指定为满量程的百分比 (% FS) 或读数的百分比 (% RD)，或两者结合。如果仪器的流速精度指定为 % FS，则与流速无关，误差均为固定值。例如，如果满量程流速为 1000 L/h，并且系统的精度为 2% FS，则在所有流速下偏差都将为 ± 20 L/h。
这意味着在流速为 100 L/h 时，偏差也将为 ± 20 L/h（或与读数值相差 ± 20%）。相反，如果系统将流速精度指定为 % RD，则误差将始终与读取值的百分比相同。在这种情况下，如果系统精度为 2% RD，则流速在 1000 L/h 时偏差为 ± 20 L/h，流速在 100 L/h 时偏差仅为 ± 2 L/h。
梯度精度和可接受梯度范围的指定
由不同泵输送的两种或更多种溶液在某个混合点混合成一种溶液时，就会形成梯度。梯度可分为两种：线性梯度和阶跃梯度。梯度精度通常用可接受梯度范围表示，在可接受的范围内定义精度（图 2）。可接受梯度范围以系统流速范围内缓冲液 B 的百分比 (% B) 表示。
可接受梯度范围根据产生梯度的每台泵中各自的流速精度确定。其中一台泵从线性梯度开始至结束（0% 到 100%）的过程中达到最小流速。随着流速下降，当一台泵的流速较低时，在高 %B 和低 %B 区域的可接受范围变窄。当超出可接受范围时，随着流速降低，% B 高的区域和低区域的精度逐渐降低。梯度精度定义为在可接受范围内与 % B 的偏差。
梯度精度也可显示为层析图谱（图 3）。层析图谱通常以单个流速表示为已编程的 % B 和实际的 % B。流速越高，混合点与层析柱之间的体积越小，梯度形成时间越长，系统的梯度性能越好。
图 2.梯度接受范围示例
图 3.梯度精度示例，其中编程梯度为绿色，实际梯度为红色
定义梯度时的考虑事项
定义梯度时，务必要考虑梯度延迟体积，即混合点与层析柱之间的体积。梯度延迟体积受混合点与层析柱之间所有组件影响，例如空气阱、过滤器以及管路内径 (i.d.)。更高的流速、更小的梯度延迟体积以及更小的管路内径均可提升梯度性能。
在图 3 中，梯度随时间变化，延迟体积可通过编程梯度与实际梯度之间的偏移量体现。理想的梯度应遵循编程梯度而无偏差。滞留量较大会导致编程梯度与实际梯度之间产生偏移。如图 3 所示，实际梯度阶跃呈现平滑曲率，直到梯度完全达到时图形才趋于平坦。这主要归因于空气阱和过滤器体积较大。为了完全交换空气阱中的缓冲液，缓冲液体积需为空气阱体积的数倍。
放大/缩小规模时的梯度
将您的方法放大规模时，必须考虑系统体积（管路、空气阱和过滤器），尤其是空气阱和过滤器的体积。每次使用在线空气阱和过滤器更换缓冲液时，都需要数倍于其体积才能完全交换缓冲液。为避免此情况，可将空气阱和过滤器设置为旁路模式，但这通常不理想且在较高流速下无需采用。
消除不同系统间阶跃梯度行为差异的另一种方法是执行系统清洗步骤。每次缓冲液更换时，系统清洗步骤是在旁路状态下对层析柱进行清洗，此时空气阱和过滤器都需要在线。此方法的效果优于将空气阱设置为旁路模式，但需要额外的缓冲液。这两种梯度操作方式均可防止松散结合的分子在洗脱缓冲液达到目标浓度前开始洗脱。图 4 说明了空气阱处于旁路和在线状态时阶跃梯度的差异。
图 4.对于以90L/h运行的6mm系统，空气阱处于旁路（左图）和在线（右图）的阶跃梯度比较
结果
ÄKTA process™ 流速精度
ÄKTA process™ 1 英寸系统的流速精度为 ±1% RD 或 1 L/h，以较大者为准。较小系统的流速精度为 ±1% RD 或 0.1 L/h，以较大者为准（表 2）。
表 2.ÄKTA process™ 系统的流速精度
| 管道 | 数据 |
|---|---|
| 6 mm聚丙烯 | ± 1% RD 或 0.1 L/h，以最大者为准 |
| 10 mm 聚丙烯 |
± 1% RD 或 0.1 L/h，以最大者为准 |
| 1 英寸聚丙烯 |
± 1% RD 或 1 L/h，以最大者为准 |
| 3/8 英寸不锈钢 |
± 1% RD 或 0.1 L/h，以最大者为准 |
| 1/2 英寸不锈钢 |
± 1% RD 或 0.1 L/h，以最大者为准 |
| 1 英寸不锈钢 |
± 1% RD 或 1 L/h，以最大者为准 |
ÄKTA process™ 梯度精度
若通过流量控制 B 缓冲液贡献，ÄKTA process™ 系统在梯度计算接受范围内的梯度控制精度为 ±1% B。当使用电导率反馈控制梯度时，反馈速度会变慢，精度为 ± 2% B。已在多个梯度设置下并通过所有不同 ÄKTA process™ 系统上的测量值对此进行了验证。不同 ÄKTA process™ 系统的测量梯度接受范围如图 5 至 7 所示。
在低流速下，无法以高精度执行梯度的全部范围（0% 至 100% B），因为较低和较高的 %B 值将超出接受范围，从而导致精度降低。因此，我们建议在使用低流速时在接受范围内使用阶跃梯度或较窄的线性梯度。在接受范围之外，精度会随着流速降低而逐渐下降。
图 5.使用 6 mm 系统时，在标准梯度下，在不同流速范围内测得的梯度接受范围 (% B)
图 6.使用 10 mm 系统时，在标准梯度下，在不同流速范围内测得的梯度接受范围 (% B)
图 7.使用 1 英寸系统时，在标准梯度下，在不同流速范围内测得的梯度接受范围 (% B)
使用流速反馈的编程和实际梯度层析图谱
图 8 至图 10 显示了使用流速反馈控制泵 B 时三种系统尺寸的编程 % B 和结果。
图 8.层析图谱显示了 6 mm 系统，其中编程梯度以绿色表示，流速为 180 L/h 时的实际梯度以蓝色表示，而流速为 90 L/h 时的实际梯度以红色表示。
图 9.层析图谱显示了 10 mm 系统，其中编程梯度以绿色表示，流速为 600 L/h 时的实际梯度以蓝色表示，而流速为 300 L/h 时的实际梯度以红色表示。
图 10.层析图谱显示了 1 英寸系统，其中编程梯度以绿色表示，流速为 2000 L/h 时的实际梯度以蓝色表示，而流速为 1000 L/h 时的实际梯度以红色表示。
使用电导率反馈的编程梯度和实际梯度层析图谱
图 11 至图 13 显示了使用电导率反馈控制泵 B 时三种系统尺寸的编程 % B 层析图谱和结果。
图 11.层析图谱显示了 6 mm 系统，其中编程梯度以绿色表示，流速为 180 L/h 时的实际梯度以蓝色表示，而流速为 90 L/h 时的实际梯度以红色表示。
图 12.层析图谱显示了 10 mm 系统，其中编程梯度以绿色表示，流速为 600 L/h 时的实际梯度以蓝色表示，而流速为 300 L/h 时的实际梯度以红色表示。
图 13.层析图谱显示了 1 英寸系统，其中编程梯度以绿色表示，流速为 2000 L/h 时的实际梯度以蓝色表示，而流速为 1000 L/h 时的实际梯度以红色表示。
梯度性能
图 14 显示了三个系统尺寸的梯度阶跃比较叠加图，每个系统在最大流速的一半时出现梯度阶跃。图中显示，较小系统启动和完成梯度阶跃所需时间更长。如前所述，在放大或缩小系统时，启动梯度阶跃的延迟由系统体积所致，而完成阶跃所需的延迟则由空气阱和滤器的体积所致。
图 14.该图显示了梯度的一个阶跃的特写，含有三个系统尺寸以各自系统最大流速一半运行的叠加图。蓝色曲线表示 1 英寸系统上流速为 1000 L/h 的情况，红色曲线表示 10 mm 系统上流速为 300 L/h 的情况，绿色曲线表示 6 mm 系统上流速为 90 L/h 的情况。
图 14 还显示，在一个系统上仅需 1 分钟即可完成的阶跃，在另一个系统上必须延长至约 5 分钟，主要原因在于空气阱中缓冲液交换的有效性。
结论
本文展示了 ÄKTA process™ 层析系统的流速和梯度精度。
- 我们已经证明 ÄKTA process™ 层析系统的流速精度为 ± 1% RD。
- 在梯度接受范围内，使用流量反馈时，梯度精度为 1% B，使用电导率反馈时，梯度精度为 2% B。
- 不同流速和压力下均表现出高精度，表明 ÄKTA process™ 系统具有高度稳定的性能。
- ÄKTA process™ 层析系统的高精度使其非常适合在 GMP 环境下实现放大和规模生产。
材料和方法
Flow accuracy of ÄKTA process™ was investigated at different flow rates, always with 3 bar back pressure and default PID parameters. The gradient accuracy and acceptance range were calculated from the flow accuracy and subsequentially tested. Gradient accuracy was also investigated by running step and linear gradients at different flow rates, using H2O as buffer A and 1% acetone and 0.1 M NaCl in H2O as buffer B.