简介
单克隆抗体 (mAb) 在过去 25 年中改变了现代医学，为癌症和自身免疫性疾病等疾病的治疗和潜在治愈带来了革命性突破。然而，确保这些复杂分子的安全性、有效性和一致性是一项重大挑战。协助识别关键质量属性 (CQA) 的工具至关重要。
获得 mAb 等生物治疗药物批准的历程漫长而复杂。这些大蛋白质需经过大量工程改造以实现预期特性，例如对其靶点的高特异性、低毒性和良好的药代动力学。同时，必须具备可制造性，即需通过纯化达到均一性，并在纯化、生产、储存及运输全过程中保持可溶性和稳定性，直至到达患者手中。
遗憾的是，在生产过程中，mAb 常发生化学和酶促翻译后修饰 (PTM)，从而产生大量分子量、电荷和疏水性不同的变体。这些修饰可影响生物治疗药物的稳定性、免疫原性、溶解度、结合亲和力和聚集体形成。
分析层析的作用
研究人员使用分析层析法来获取有关 mAb 特性（包括纯度、稳定性和结构完整性）的宝贵见解。这些信息对于优化生产、纯化和储存流程至关重要。
在治疗性蛋白质（例如 mAb）的开发和制造过程中，聚集体是一个重要关注点。聚集体可对产品的稳定性、保质期和有效性产生负面影响，还可能给患者带来免疫原性和安全性风险。通过监测整个制造过程中的聚集体水平，科学家可采取纠正措施来优化生产并最大限度地减少聚集体的形成。尺寸排阻层析法 (SEC) 是一项用于量化和表征 mAb 聚集体的技术。它可以根据样本中聚集体的大小对其进行分离和测量。
另一个需要考虑的重要方面是电荷变体，也称为电荷异质性。这是指 mAb 样本中存在不同的电荷变体。电荷变体可能由脱酰胺化、氧化、糖基化或 C 端赖氨酸剪切等翻译后修饰引起。这些带电变体可显著影响 mAb 的稳定性、药代动力学和免疫原性，这强调了对其彻底表征的必要性。离子交换层析法 (IEX) 利用 mAb 变体之间的净电荷差异，实现分离和定量。这些信息对于确保批次间一致性和优化配方策略至关重要。
以 mAb 样本异质性分析为例，我们建立了一个实验室规模的流程，用于评估在 CHO 细胞中表达的 mAb 的关键质量属性 (CQA)。mAb 经两步纯化：使用 MabSelect PrismA™ 填料的亲和层析和使用 Capto™ S ImpAct 填料的 IEX。每步纯化后均进行分析层析，以指导组分收集（图 1）。
图 1.mAb 纯化过程流程图及分析层析法分析。亲和纯化后，使用分析型 SEC 评估聚集情况。将亲和纯化的 mAb 进一步使用 IEX 纯化，并通过分析型 SEC 和 IEX 分别进行分馏，以估算聚集体含量和带电变体。将对应于最低聚集体含量和主要 mAb 变体的组分收集。最终收集样本通过分析型 SEC 和 IEX 进行分析。
分析型 SEC
将亲和纯化得到的组分进行中和，然后使用 ÄKTA pure™ 微型系统进行分析型 SEC 检测（图 2）。ÄKTA pure™ 微型系统带有低滞留体积流路，非常适用于制备和分析层析法。样本通过专用于微量和分析应用的ALIAS™ 生物自动进样器注入。
图 2.使用 ÄKTA pure™ 微型系统和 ALIAS™ 自动进样器在 Superdex™ 200 Increase 3.2/300 柱上进行聚集体分析的分析型 SEC。*首次运行前，用 1.5 CV 预平衡层析柱。
通过 UNICORN™ 软件对峰面积进行积分计算，确定聚集体含量。亲和纯化后的各组分聚集体含量为 1-2%（图 3）。
图 3. a)显示 mAb 亲和纯化的层析图谱。b) 来自亲和层析的四个组分（分别代表峰的起始、中部和尾部），使用 ÄKTA pure™ 微型系统进行分析型 SEC 检测。峰面积积分表明主峰中每个组分的聚集体含量为 1-2%。c) 分析型 SEC 层析图谱的放大图像。各层析图谱中位于主峰之前的次峰对应 mAb 聚集体。d) 亲和层析图谱的峰中各组分的聚集含量 (%)。
分析型 IEX 层析
将收集到的 85-93 mL 的亲和层析组分合并，并在装有 8 mLCapto™ S ImpAct 填料的 Tricorn™ 10/100 柱上进行纯化。主 IEX 峰的峰型表明存在带电变体和聚集体（图 4）。
为评估聚集体含量，对覆盖该峰的每隔一个组分样本进行了分析型 SEC 分析（图 4）。对峰进行积分，估计 110 至 125 mL 收集组分的聚集体含量 < />
图 4. a) 显示 IEX 纯化的层析图谱形状表明存在带电变体和片段。b) 使用分析型 SEC 分析 IEX 纯化中的选定组分。c) 各峰的聚集体（灰色）和片段（黄色）含量 (%)。
相同的组分也用分析型 IEX 进行检测。检测之前，先用Amersham™ MicroSpin™ G-25 柱对 50 µL 的各组分脱盐，并在缓冲液 A 中以 1:1 的比例稀释。50 µL 脱盐和稀释的样本以高分辨率 IEX 根据包含阶跃梯度和线性梯度的纯化方案使用Capto™ HiRes S 5/50柱进行分析（图 5）。
图 5.使用 ÄKTA pure™ 微型系统和 ALIAS™ 自动进样器在 Capto™ HiRes S 5/50 柱上分析带电变体的分析型 IEX 方案。
对应于碎片化、酸性、主峰和碱性抗体变体的峰（图 6）进行手动积分，并计算峰面积。
图 6. a)显示 IEX 纯化的层析图谱。b) 分析了 IEX 后主峰的三个组分。根据先前数据（未显示），该峰通常由片段、酸性、主峰和碱性变体组成。c) 这些变体（蓝色为聚集体、绿色为酸性变体、黄色为碱性变体）的分布和数量 (%) 见底部层析图谱。
将这两次分析运行的数据结合，得出了比仅使用 SEC 聚集数据更严格的合并策略。最终收集了 115-125 mL 之间的组分并进行储存。长期储存后，采用 SEC 和 IEX 分析最终合并样本（图 7）。尽管 IEX 仍显示存在少量片段和其他变体，但可溶性单体 mAb 的最终收率为 55%，根据我们之前对该 mAb 的经验（未显示），该比例相对较低。本研究表明，在多步纯化过程中运行分析层析法有获益，其结果可用于优化组分收集，同时也可作为储存后蛋白样本的快速质量检查。
图 7. 使用 a) 分析型 SEC 和 b) IEX 进行的最终分析表明，即使经过较长的储存期，可溶性单体 mAb 仍是合并库中的主要物质，且聚集体、片段和带电变体的含量较低。
总结和结论
- 本研究展示了结合使用 ÄKTA pure™ 微型系统与 ALIAS™ 生物自动进样器来评估 mAb 的 CQA。
- 在ÄKTA pure™ 25 M 系统上使用亲和层析和离子交换层析法从 CHO 上清液中纯化出高表达的单克隆抗体 (mAb)。在
- 在每个纯化步骤后，使用 ÄKTA pure™ 微型系统在 Superdex 200 Increase 3.2/300 柱上对 10 µL 的中和组分进行分析型 SEC 检测，以确定聚集体含量。
- 经过制备型离子交换层析后，使用 ÄKTA pure™ 微型系统在 Capto™ HiRes S 5/50 柱上对 50 µl 脱盐和稀释后的组分进行分析型 IEX 检测，以评估混合带电变体群。
- 分析型 SEC 和 IEX 获得的信息可指导用户采用极佳的组分收集策略，以获得聚集体、片段和带电变体含量更低的纯化样本。
- 分析型 SEC 还可用于快速检查储存后蛋白质样本的质量。
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