蛋白 A 亲和层析是用于捕获抗体或 Fc 融合蛋白的主要纯化技术，并让下游工艺的平台化方案建设提供了可能。近年来，出现了多种高结合载量的现代蛋白 A 填料，它们还声称耐碱性高达 0.5 M NaOH，还可进行经济高效的清洁。但所有这些蛋白 A 填料是否都具有同样的耐碱性？这对填料使用寿命和纯化性能有何影响？
我们进行了 150 次循环的填料使用寿命研究，在每次循环中使用澄清的细胞收获物，以评价三种蛋白 A 填料的耐碱稳定性 — MabSelect™ PrismA (Cytiva)、Praesto™ Jetted A50 (Purolite Corp.) 和 Amsphere™ A3 (JSR Corp.)。
我们得出的结果是：
- 进行 150 次循环后（每次循环后使用 0.5 M NaOH 进行原位清洁），MabSelect™ PrismA的剩余mAb动态结合载量（DBC）约为90%，而 Amsphere™ A3 填料只有约 60%。此外，在仅 120 次循环后，Praesto™ Jetted A50 的剩余 DBC 约为 40%。
- 对于 MabSelect™ PrismA（上样至原始 DBC 的 80%），循环后 mAb 收率高于 80%，Praesto™ Jetted 和 Amsphere™ A3 的收率分别在 60 和 100 次循环时相对较快地降至该水平以下。
- 对于所有三种填料，洗脱液中的蛋白 A 脱落、聚集体和 HCP 水平均较低且一致。对应填料的收率降至80%以下时，测量杂质含量。
引言
在过去 40 年中，蛋白 A 层析填料带来的年生产率增长和载量增长分别达到了 4.3% 和 5.5%。仅在过去 15 年中，蛋白 A 填料的结合载量即从 30 g/L 显著增加到 70 g/L。
蛋白 A 填料的主要遗留问题之一是蛋白配基的耐碱稳定性相对较低。细胞培养收获物中营养负荷较高，同时蛋白 A 填料的耐碱性较低，导致出现填料结垢和生物负荷问题的风险增加。近年来，出现了多种高结合载量的现代蛋白 A 填料，它们还声称具有耐碱性高达0.5 M NaOH甚至更多。
然而，问题是所有这些耐碱性蛋白 A 填料是否都具有同样的耐碱性？这对治疗性 mAb 纯化工艺的工艺经济性有何影响？
蛋白 A 配基结构设计
蛋白 A 是一种金黄色葡萄球菌细胞表面蛋白，由五个 IgG 结合域组成，分子量 (Mr) 为 42,000。不同的供应商采用了不同的基因工程方法。在 MabSelect™ PrismA 配基的开发中，进行了 B 结构域的多聚化（图 1）。选定结构域已通过位点定向诱变进行进一步的碱稳定化，其中敏感的氨基酸已更换为更稳定的氨基酸。
图 1. MabSelect™ PrismA 配基开发。该配基是一种源自蛋白 A 的 B 结构域的重组蛋白。尽管基于与 MabSelect SuRe™ 填料相同的结构域，但选定结构域已通过位点定向诱变进行进一步的碱稳定化，其中敏感的氨基酸已交换为更稳定的氨基酸。
基于使用寿命研究蛋白 A 填料标杆分析
在这项标杆分析研究中，我们研究了三种现代蛋白 A 填料 — 它们全部声称在 0.5 M NaOH 下具有耐碱性。与使用较低 NaOH 浓度的 CIP 相比，浓度为 0.5 M NaOH 时可提供更高效的清洁和改进的生物负荷控制。出于这种考虑，我们检测了当今市场上三种填料声称的耐碱稳定性 — Cytiva 的 MabSelect™ PrismA、Praesto™ A50 Jetted (Purolite) 和 Amsphere™ A3 (JSR)。
装填至 Tricorn™ 层析柱后，我们对每种填料进行了大量的填料使用寿命性能研究，其中对澄清的细胞收获物进行了多达 150 次循环。定期（每 10 次循环）测量动态结合载量 (DBC) 和纯化性能，并在每次循环后对所有填料用 0.5 M NaOH 进行 15 min 的 CIP 处理。
三种填料的基本特性见表 1。
表 1 研究中检测的填料的基本特性
| 特性 |
MabSelect™ PrismA Cytiva |
Praesto™ Jetted A50 Purolite |
Amsphere™ A3 JSR |
| 粒径 (µm) | 60 | 50 | 50 |
| 声称的流速 (cm/h) | 300* | 300† | 1200‡ |
| 技术 | 高流速琼脂糖 | 高度交联琼脂糖和喷射微珠 | 甲基丙烯酸聚合物 |
| 声称的载量 | 80 g/L，6 min 停留时间 (RT) | 80 g/L，10 min 停留时间 50 g/L，3 min 停留时间 |
54 g/L，4 min 停留时间 |
| 声称的耐碱稳定性 | 0.5 至 1.0 M NaOH | 高达 0.5 M NaOH | 0.1 至 0.5 M NaOH |
* 在 20°C、1 bar (0.1 MPa, 14.5 psi) 背压下，使用与水粘度相同的缓冲液，装填在柱床高度为 20 cm 的 30 cm 内径 AxiChrom™ 300 层析柱中。
† 基于规定的 300 cm/h，内径 2.6 cm，柱床高度 20 cm，背压 3 bar (0.3 MPa, 43.5 psi)。
‡ 填料最大操作流速。网页上显示该流速随层析柱尺寸的变化而变化，需要考虑层析柱和系统压力限制。
Praesto™ Jetted A50 值获取自 purolite.com/ls-product/jetted-a50，2020 年 12 月 14 日访问。”
Amsphere™ A3 值获取自 jsrmicro.be/sites/default/files/attachments/amsphere_a3_operational_conditions.pdf，2020 年 12 月 14 日访问。
参见页面底部，获取详细的材料和方法。本文中描述的所有研究均于 2020 年在乌普萨拉的 Cytiva 进行。所有数据均保存在乌普萨拉的 Cytiva。
结果
mAb 的动态结合载量和收率
按照供应商的说明，使用填料装填 Tricorn™ 5/100 层析柱。评价了每种填料的纯化 mAb 在 10% 穿透率时的初始结合载量 (Qb10)，层析柱上的停留时间为 6 min。
表 2 中的结果表明，使用 MabSelect™ PrismA 得到的 mAb 的 DBC 最高，而 Praesto™ Jetted A50，尤其是 Amsphere™ A3 的初始 DBC 较低。
表 2. 使用寿命研究中 10% 穿透率时的初始 DBC 和 mAb 上样量
| 填料 |
初始 Qb10（mg mAb/mL 填料） |
上样量（mg mAb/mL 填料） |
| MabSelect™ PrismA | 65.4 | 52.3 |
| Praesto™ Jetted A50 | 59.3 | 47.4 |
| Amsphere™ A3 | 51.3 | 41.0 |
基于初始 DBC 评价，我们将从细胞培养液（HCCF）中收获的 mAb 上样至 Qb10 的 80%。针对 150 次循环（每次循环中包括使用 0.5 M NaOH 进行 CIP）进行了使用寿命研究。然而，对于 Praesto™ Jetted A50，我们在 120 次循环时停止了研究，因为我们观察到 DBC 和收率均出现大幅降低（图 2 和 3）。
150 次循环后，MabSelect™ PrismA 维持了初始 DBC 的约 90%，而 Amsphere™ A3 降至只有 60%。对于 Praesto™ Jetted A50，我们观察到不良结果，DBC 在仅 120 次循环后就降至 40% 以下。
图 2. 多达 150 次循环内 Cytiva 的 MabSelect™ PrismA 对比 Praesto™ Jetted A50 和 Amsphere™ A3 的 mAb 的相对剩余 DBC。
图 3. 多达 150 次循环的使用寿命研究中三种层析柱的 mAb 收率。HCCF中获得的mAb上样量设定为 Qb10的80%，基于在研究开始时用纯mAb测定的 Qb10。
MabSelect™ PrismA 在整个使用寿命研究中的收率始终高于 80%（图 3）。Praesto™ Jetted A50 和 Amsphere™ A3 中上样的 mAb 收率则不然，前者在仅 60 次循环后就低于 80%，后者在 100 次循环后降至 80% 收率以下。
MabSelect™ PrismA 还显示出稳健的耐碱稳定性，因为直到 HCCF 上样阶段的第 150 次循环未观察到 mAb 穿透（图 4A）。另外两种填料 Praesto™ Jetted A50 和 Amsphere™ A3 仅在 60 次循环后样品上样中的 mAb 就出现穿透，这是它们载量下降的进一步证据（图 4B 和 C）。
层析柱：Tricorn™ 5/100 (CV 2 mL)
上样：HCCF中的mAb，上样量为RT 6 min，mAb的80% Qb Qb10
洗脱缓冲液：50 mM 乙酸钠，pH 值 3.5
CIP：0.5 M NaOH，每次循环后持续 15 min
图 4. 使用寿命研究穿透曲线叠加图显示 HCCF 上样阶段 0.5 M NaOH CIP 对 mAb 穿透 (A) MabSelect™ PrismA、(B) Praesto™ Jetted A50 和 (C) Amsphere™ A3 蛋白 A 填料产生的影响。
如图 4B 所示，仅在第 60 次循环时我们就在 Praesto™ Jetted A50 的穿透液中观察到了 mAb 穿透（偏离平台期），之后每次循环的穿透出现时间更早。此外，洗脱曲线随着循环次数的增加而改变形状，洗脱峰降低，条带和 CIP 峰升高。
使用寿命研究中的杂质分析
我们从使用寿命研究中采集了洗脱液，并分析了 HCP（图 5）、聚集体（图 6）和蛋白 A 脱落（图 7）等杂质。
每种填料收率降至80%以下时，测量洗脱液中的HCP含量。来自 MabSelect™ PrismA 的洗脱液中的 HCP 较低。Amsphere™ A3 层析柱上的 HCP 含量相似，而使用 Praesto™ Jetted A50 时观察到的水平略低。
图 5. 使用寿命研究中三种填料的洗脱液中的 HCP 含量。进行了多达 150 次循环，每次循环后进行 0.5 M NaOH CIP。进行测量直到收率降至 80%。使用 Gyros™ Protein Technologies 的 CHO HCP E3G 试剂盒对 HCP 进行定量测定。
图 6. 使用寿命研究中三种填料的洗脱液中的聚集体。进行了多达 150 次循环，每次循环后进行 0.5 M NaOH CIP。进行测量直到收率降至 80%。使用 Superdex™ 200 Increase 层析柱对聚集体进行定量测定。
如图 6 所示，所有三种填料的聚集体水平相对一致。
MabSelect™ PrismA 具有一致的蛋白 A 脱落水平 (< 25 ppm)，Praesto™ Jetted A50 和 Amsphere™ A3 的水平略低，但由于使用的分析方法不同，难以进行比较。在使用寿命研究的第一次运行中，我们确定所有填料的蛋白 A 脱落约为 35 ppm。根据早期结果（图 7），第一次运行时预计数值较高。
图 7. 使用寿命研究中三种填料的洗脱液中的蛋白 A 配基脱落。进行了多达 150 次循环，每次循环后进行 0.5 M NaOH CIP。进行测量直到收率降至 80%。使用 Repligen™ 的 ELISA 试剂盒对配基脱落进行定量测定，其中 MabSelect™ PrismA 作为 MabSelect™ PrismA 的标准品、NGL 作为 Praesto™ Jetted A50 的标准品和 rProtein A 作为 Amsphere™ A3 的标准品。
结论
- 与 Praesto™ Jetted A50 或 Amsphere™ A3 相比，MabSelect™ PrismA 在多达 150 次循环内在 0.5 M NaOH 下的耐碱稳定性最高和使用寿命最长
- 当使用 0.5 M NaOH 进行 CIP 时，MabSelect™ PrismA 的使用寿命约为 Praesto™ Jetted A50 的两倍
- 在多达 150 次循环内观察到 MabSelect™ PrismA 具有一致的纯化性能
- MabSelect™ PrismA 改进的生物负荷控制和更长的填料使用寿命应该能够转化为良好的工艺经济性
- 与使用较低 NaOH 浓度的 CIP 相比，使用 0.5 M NaOH 的 CIP 可实现更高效的清洁和改进的生物负荷控制