iCELLis™ 生物反应器的应用和工艺文献综述

背景和介绍

贴壁细胞培养工艺利用基质表面，使细胞能够在可控的人工环境中附着、生长和增殖。贴壁条件下的细胞培养为用于治疗目的的病毒载体生物制造提供了宝贵的平台。慢病毒 (LV)、腺病毒和腺相关病毒 (AAV) 是细胞和基因治疗中用于遗传物质递送的关键治疗剂，通常采用贴壁细胞培养技术进行生产。传统细胞培养方法主要依赖于使用塑料平底容器（如方瓶）或多托盘系统。然而，在过去十年中，我们对细胞和基因治疗产品的需求显著增长，这推动了更适合的生产方式进步。填充床式生物反应器可实现病毒载体的高效生产。然而，在填充床式生物反应器中建立新工艺面临着识别操作空间和工艺放大方面的不同挑战。确定最佳细胞培养参数和条件通常需要进行密集的工艺开发工作。iCELLis 生物反应器是用于贴壁细胞培养工艺的一次性可放大性填充床式生物反应器。截至 2023 年，美国六种获批的基因治疗产品中有四种使用 iCELLis 技术，包括一种腺病毒、一种溶瘤病毒和两种 AAV 工艺。在本综述中，我们评估了 iCELLis™ 生物反应器系列多种应用的近期出版物，为开发新工艺的研究人员提供概述和指导。第一节介绍了该技术的特点。随后，描述了 AAV 和 LV（基因治疗的主要病毒载体）的常见工艺条件，例如细胞系、细胞密度、培养基组成、补料策略、转染方法及操作参数（pH 值、溶解氧、温度）。最后，概述了溶瘤疗法、疫苗、重组蛋白和细胞外囊泡的生产。

 

图 1.iCELLis 生物反应器：(A) iCELLis Nano 生物反应器；(B) iCELLis 500+ 生物反应器。

技术概述

iCELLis 生物反应器是一次性填充床式生物反应器，可实现可放大性贴壁细胞培养以生产无需细胞回收的产品，例如病毒载体、重组蛋白和细胞外囊泡。通过对 pH、溶解氧 (DO)、温度和生物量进行自动化、精确的监测和控制，这些生物反应器为贴壁细胞提供了极佳生长条件。填充床是该系列生物反应器的关键特征，可实现高细胞密度和高病毒颗粒生产力。iCELLis 生物反应器系列包括两个系统：iCELLis Nano 生物反应器和 iCELLis 500+ 生物反应器（图 1）。两者共同构成从实验室规模到商业生产规模的可放大性平台。

根据填充床中载体的高度和压实程度，可采用不同的配置。iCELLis Nano 生物反应器（实验室规模生物反应器）提供的细胞生长表面积从最小 0.53 m² 到最大 4 m² ，而 iCELLis 500+ 生物反应器（生产规模生物反应器）支持的细胞生长表面积从66 m² 到 500 m²。两款生物反应器均配备三种填充床高度：2 cm、4 cm 和 10 cm。iCELLis Nano 生物反应器的直径为 11 cm，而 iCELLis 500+ 生物反应器的直径增加至 86 cm，由于几何形状相似，可相对简单实现放大生产。iCELLis Nano 生物反应器的工作容量范围从 600 mL 到最大 900 mL，而 iCELLis 500+ 生物反应器支持的工作容量高达约 70 L。对于培养基和营养物质需求增加的生产工艺，可在 iCELLis 生物反应器中执行再循环和灌注方法。

iCELLis 生物反应器的 12 种配置摘要如表 1 所示。

表 1.iCELLis Nano 生物反应器和 iCELLis 500+ 生物反应器的配置

生物反应器	生物反应器直径 (cm)	填充床高度 (cm)	生物反应器工作体积 volume	表面积(m2) 低压实	表面积(m2) 高压实
iCELLis Nano	11	2	600 mL– 900 mL	0.53	0.8
iCELLis Nano	11	4	600 mL– 900 mL	1.06	1.6
iCELLis Nano	11	10	600 mL– 900 mL	2.65	4
iCELLis 500+	86	2	~ 70 L	66	100
iCELLis 500+	86	4	~ 70 L	133	200
iCELLis 500+	86	10	~ 70 L	333	500

 

磁力叶轮确保细胞培养基在 iCELLis 生物反应器内部从填充床底部至顶部进行循环（图 2）。培养基以薄液膜形式从顶部下落，在此过程中获得氧气，从而在生物反应器内实现高效气液传质，同时保持低剪切力。

 

图 2.iCELLis 500+ 生物反应器中的培养基循环流动。

得益于填充床设计、低剪切搅拌、极佳培养基循环以及精确的细胞培养参数调控，iCELLis 生物反应器可实现高活细胞密度和高病毒颗粒滴度。在本应用说明中，我们阐述并总结了涉及 iCELLis 生物反应器作为可放大性从实验室到大规模生物生产的各种工艺，包括病毒载体、疫苗、蛋白质和外泌体的生产。

AAV 工艺

近年来，AAV 因其安全性、有效性以及感染不同细胞的能力而在基因治疗中发挥了关键作用 (1)。目前，针对这种载体开展了多项临床研究，而首批获批的两种 AAV 基治疗药物中，Zolgensma 在 iCELLis 生物反应器中生产 (2)。尽管一些疗法已获得市场批准，但这些病毒载体的生产仍面临挑战，主要是放大生产的问题。最常见的生产方法是采用 2D 烧瓶，工艺控制有限。在此背景下，iCELLis 生物反应器的最新研究表明，它是一个适合扩大 AAV 生产规模的系统，通过提供一个受控环境，旨在实现高细胞密度、提高病毒产量以及从研发到生产规模的批次间一致性。

在 HEK293 贴壁细胞培养中使用聚乙烯亚胺 (PEI) 进行三重瞬时转染是在 iCELLis 生物反应器中进行的主要 AAV 生产方法。文献表明，该工艺从 2D 平底培养皿至 iCELLis 生物反应器的成功技术转移取决于细胞系适应性、转染方法的效率以及病毒载体质量属性的维持 (3，4，5，6，7)。针对这些特征，研究人员对众多工艺参数进行了全面审查，并获得了工艺控制的理想范围。其中部分参数列于表 2 中。这些发现可以作为 AAV 生产开发的指导，但每项工艺能都有其特殊性，且需要进一步的优化研究。

表 2. 文献中用于 iCELLis 生物反应器中 AAV 生产的最常见参数总结

工艺参数	范围	单位
接种密度	6000–100 000	个细胞/cm2
转染密度	150 000–250 000	个细胞/cm2
DNA 与细胞比值	0.1 -2.0	µg 总 DNA/百万个细胞 million cells
PEI 与 DNA 比值	3:1 和 2:1	mg/mg
DO设定值	40–50	空气饱和度%
pH 设定值	7.1–7.4
温度设定值	37	°C
线性速度	0.75–2.5	cm/s
转染后收获时间	72–96	小时

表中列出的参数总结了截至本文撰写时可用的文献信息，并不构成推荐条件。联系您的 Cytiva 上游应用科学家以获取建议。

 

尽管稳定包装细胞系有望实现更高的产量 (8)，但源自 HEK293 的细胞株仍是 iCELLis 生物反应器中最常用的宿主。一般而言，接种密度从 6000 至 100 000 个细胞/cm2 不等，且 10 000 个细胞/cm2 最为常见 (3，4，9，6，10)。转染时，对 70 000 至 250 000 个细胞/cm²的广泛细胞密度进行了测试 (6，11)。Alfano 等人 (2021) (11) 在无血清培养基中以 70 000 个细胞/cm²的密度接种，其滴度显著高于以 200 000 细胞/cm²的密度。此外，Illingworth 等人 (2014) (12) 和 Pegel 等人 (2013) (13) 在转染密度高于 200 000 个细胞/cm²时，获得的产量低于对照烧瓶。因此，数据表明，在此范围内较低的转染密度有利于 AAV 生产。

对于培养和生产，选择了不同的培养基组成，其中胎牛血清 (FBS) 含量范围为 0% 至 10% 不等 (3，9，6，10)。除培养基组成外，还评估了进料方法。研究在培养阶段进行了培养基循环，转染前后进行了培养基交换，并在生产阶段进行了灌注。Nass 等人 (2019) (10) 观察到转染后载体产量与工作体积之间存在直接相关性。此外，Lefebvre 等人 (2017) (6) 通过转染后培养基交换实现了高达 8 倍的生产力提升。此外，他们观察到停止培养基再循环可增加细胞-载体接触，从而提高转染效率。

有报道指出，一些参数对转染过程的效率至关重要，例如 DNA 与细胞的比率（0.1–2.0 µg DNA/百万细胞）(9)、PEI 与 DNA 的比率（3:1 和 2:1 mg/mg）(4，9，10)、复合物孵育时间 (10)、复合物与细胞接触时间 (10)、转染后培养基交换 (9) 以及收获时间（转染后 72 至 96 小时）(9)。收获的另一个确定关键变量是 AAV 血清型，因为它将决定理想的收获日期以及细胞内或细胞外载体的回收方法 (3)。

无论血清型如何，在 iCELLis 生物反应器中均可获得 AAV 血清型 5、8、9 和重组载体的高产。在这些研究中，评估了不同的填充床高度（0.53 至 4m² ) 和压实度（1× 和 1.5×），主要工艺参数为：溶解氧（DO）保持在空气饱和度的 40% 至 50％；pH 设定值在 7.1 至 7.4 之间，采用单侧控制（仅 CO²)，7.2 为最常见值；整个培养过程中温度保持在 37°C。另一个关键参数是培养基在填充床中循环的线性速度，因为它对气体交换、载体与细胞间的接触时间以及获得低剪切应力水平至关重要。研究了 0.75 至 2.5 cm/s 的线性速度，并在过程中进行了调整以维持理想条件，例如维持细胞生长和减少产品降解 (3，4，6，9，10)。

化学裂解是最常报道的方法，涉及使用不同缓冲液（Tris 和 HEPES）、盐类（NaCl 和 MgCl² )以及添加核酸酶 (6，7，9，10)。收获后，冲洗可通过回收额外的 AAV 提高收率 (7)。许多研究获得了10⁸ 至 10¹⁰ 个病毒基因组/cm²。在其中一些中，iCELLis 生物反应器的收率与多托盘烧瓶（CellSTACK (CS) 和 Cell Factory (CF)）相当。然而，仍存在一些局限性，可能需要进一步优化工艺流程才能获得与参比系统相当的生产力，如表 3 所示。在这篇综述中，我们仅总结了 iCELLis Nano 生物反应器中的研究。iCELLis 500+ 生物反应器的基本放大策略是使用 Cytiva 的放大工具保持填充床特性（高度和压实度）和氧气的体积传质系数。如对工艺开发和放大规模感兴趣，请联系您的 FAS（现场应用科学家）代表。

表 3.文献中发表的 AAV 生产力

产品	细胞系	生物反应器 尺寸 (m2)	iCELLis 收率	对照烧瓶收率	来源
rAAV2	A549（稳定包装细胞系）	0.53	4.5 × 108 vg/cm2	3.1 × 108 vg/cm2 (CS5)	Lennaertz et al. (2013) (3)
AAV-5	HEK293T	0.53	5.5 × 109 vg/cm2	5.6 × 109 vg/cm2 (CS10)	Lennaertz et al. (2013) (3)
rAAV-8	HEK293	0.8 4	4.5 × 109 vg/cm2 3.4 × 109 vg/cm2	不适用	Lefebvre et al. (2017) (6)
AAV	HEK293	4	4.0 × 109 vg/cm2	1.9 × 109 vg/cm2 (CS10)	Nass et al. (2019) (10)
AAV human factor IX	HEK293T/17	0.53	6.9 × 1010 vp/cm2	2.5 × 1011 vp/cm2 (CF10)	Powers et al. (2016) (5)
rrAAV-2	HEK293T	0.53	2.2 × 1010 vg/cm2	4.7 × 1010 vg/cm2 (CS10)	Pegel et al. (2013) (13)
rAAV5	HEK293T	0.53	4.4 × 109 vg/cm2	6.3 × 109 vg/cm2 (CS10)	Illingworth et al. (2014) (12)
rAAV	HEK293T	0.53	2.2 ×1010 vg/cm2	4.7 × 1010 vg/cm2 (CS10)	Emmerling et al. (2016) (4)
AAV	HEK293	4	6.8 × 1010 vg/cm2	不适用	Kaspar et al. (2019) (7)

注：CS5 = CellSTACK 5 层培养室，CS10 = CellSTACK 10 层培养室，CF10 = Cell Factory 10 层培养室

 

慢病毒工艺

LV 载体是继 AAV 之后应用最广泛的病毒载体，目前在 30% 的在研基因疗法中得到应用 (14)。这主要归因于其固有特性——既能转导分裂细胞也能转导非分裂细胞，从而能够将基因递送至广泛的哺乳动物细胞系中。它们还具有永久整合到宿主细胞基因组的能力 (15)，并且在靶细胞中引发相对较低的免疫应答 (14)。根据现有文献，当前使用的 iCELLis 工艺参数范围总结如表 4 所示。

表 4. 文献中用于 iCELLis 生物反应器中 LV 生产的最常见参数总结

工艺参数	范围	单位
接种密度	7000–15 000	个细胞/cm2
转染细胞密度	60 000–250 000	个细胞/cm2
质粒浓度	200–400	ng（总 DNA）/cm2
DNA 与 PEI 比值	1:1 和 1:2	mg/mg
DO设定值	40–55	空气饱和度%
pH 空气饱和度%	转染前 7.0–7.25 转染后 6.8–7.0
温度设定值	37	°C
线性速度	1–3	cm/s
转染后收获时间	24–96	hours

表中列出的参数总结了截至本文撰写时可用的文献信息，并不构成推荐条件。联系您的 Cytiva 生物反应器应用科学家以获取建议。

 

主要的 LV 生产平台涉及瞬时转染。然而，瞬时转染步骤不易重现，导致批次间存在异质性。此外，使用临床级质粒和转染试剂成本高昂。因此，有必要开发稳定的生产细胞系。Powers 等人 (2020) (5) 开发了 GPRTG-EF1α-hγc 稳定包装细胞系，该细胞系产生的 LV 滴度和载体转导效率与 10 层多托盘系统产生的 LV 滴度和载体转导效率相当。然而，更稳定的细胞系的开发还需要一些时间，因此 HEK293 细胞系仍然是最常用的。一般而言，细胞接种密度范围为 7000 至 15000 个细胞/cm² ，转染时目标细胞密度范围为 60 000 至 250 000 个细胞//cm²，这可能在接种后第 2 天至第 4 天实现 (5，11，16，17，18，19，20，21，22)。

在培养基成分方面，通常向高葡萄糖培养基中添加 10% FBS，因为它为 HEK293 细胞有效生长提供营养。此外，FBS 中的脂肪酸和脂质有助于保护 LV 载体的稳定性 (17)。然而，对于 FBS 的稳定性和一致性，仍然存在一些担忧。此外，培养基中存在 FBS 会给下游处理带来挑战，且长期来看，FBS 的可用性将面临问题。

在当前的实践中，有两种类型的质粒系统：第 2 代系统（使用三个独立的质粒）和第 3 代系统（使用四个独立的质粒）。第三代系统使用得更频繁，原因是它更安全，可从系统中消除 HIV 蛋白 (23)。常用的转染试剂是 PEI，因为它对 pH 值变化的敏感度较低，毒性比磷酸钙低得多，而且相对便宜 (15)。影响转染效率的关键参数包括 DNA 与 PEI 的比值（1:1 或 1:2）和质粒浓度，后者范围为 200–400 ng/cm²(16，17，18，19，21，22，24)。近期研究还表明，转铁蛋白介导的转染可提升转染效率 (20，21)。

目前已对不同的填充床高度（0.53 至 333 m²）和压实度 (1× 和 1.5×) 进行了评估。评估发现，低压实填充床单位表面积生产力更高 (16)。主要工艺参数如下：DO 维持在空气饱和度的 40%-55%；培养批次期间温度为 37℃；转染前 pH 值控制在 7.0-7.25，转染后 pH 值控制在 6.8-7.0 (5，11，16，17，19，20，21，22)。研究表明，较低的 pH 值会增加 LV 的生产效率 (16)。在细胞生长过程中，线性速度在 1-2 cm/s 之间变化，在接种和转染期间，搅拌速度较高，为 2-3 cm/s，以确保填充床中的均匀性 (5，11，16，17，19，20，21，22)。

由于 LV 在室温下稳定性较低，灌注可减少下游处理前的放置时间、减少单次处理体积及高效收集产物，从而维持载体生物活性。Yoganathan 等人 (2020) (19) 报告称，在 iCELLis Nano 生物反应器罐体中测得的 LV 载体颗粒浓度随时间推移而降低，而在外部灌注瓶内浓度则持续上升。Fiol 等人(2023) (25) 报告称，灌注工艺的 LV 收率是批次工艺的两倍。在灌注模式下，就目标葡萄糖浓度或实现该浓度的灌注速度而言，可采用多种策略。不同的研究团队已进行了实验，目标是将生物反应器中的葡萄糖浓度控制在 0.5 至 2g/L 之间。Valkama 等人 (2018) (16) 发现，当目标葡萄糖浓度设定为较低（为 0.5 g/L）时，细胞可在较低葡萄糖浓度下很好地增殖。总体而言，这导致所需灌注培养基和总产品体积的减少。LV 收集通常可在转染后 2 天开始，因为转染试剂应已完全清除 (16)。

表 5.文献中发表的 LV 生产力

细胞系	生物反应器尺寸 (m2)	产品收率	对照平底培养皿	来源
HEK293T	2.67 4	2.2 × 105 –3.7 × 105 TU/cm2 5.2 × 104 – 2.9 × 105 TU/cm2	7.12 × 105 TU/cm2	Valkama et al (2018) (16)
HEK293T	2.67 333	5.4 × 104 – 6.7 × 105 TU/cm2 6.1 × 104 TU/cm2	-	Leinonen et al. (2019) (17)
HEK293T	2.67	4.9 × 105 –6.4 × 105 TU/cm2	9.8 × 105 TU/cm2 (Macrocarrier)	Leinonen et al. (2020) (18)
HEK293T	0.53	6 × 104 TU/cm2	4.3 × 104 TU/cm2	Yoganathan et al. (2020)
HEK293T	100 333	1.3 × 106 TU/mL 2.0 × 109 TU/mL	-	Valkama et al. (2020)
HEK293T	0.53	1.1 × 107 IFU/mL	6.3 × 107 IFU/mL	Alfano et al. (2021)
HEK293T	0.53 66	1.0 × 108 GC/cm2 3.5 × 108 GC/cm2	-	Pelletier et al. (2021) (25)
HEK293T	0.53	1.2 × 106 TU/cm2	2.7 × 107 TU/cm2	Fiol et al. (2023) (25)
CD34+	2.6	1.7 × 107 TU/cm2	1.6 × 107 TU/mL	Powers et al. (2020) (5)

 

收获后，iCELLis 生物反应器可产出 5.2 × 10⁴至 1.7 × 10⁷转导单位 (TU)/cm²的 LV 载体 (5，16，17，18)，如表 5 所示。尽管有报告称，单位表面积的生产力低于平底培养皿 (16)，但即使在这种情况下，在 2.67 m²iCELLis Nano 生物反应器运行中产生的总转导单位大约是 500 cm²TripleFlask 的 30 倍，最多相当于 100 多个 TripleFlask 单位 (16)。为进一步提高生产力，研究人员需要考虑以下方面：开发稳定的生产细胞系，通过灌注优化收获条件，以及设计下游工艺以高效处理大量产品，同时保持载体功能并最大限度地减少产品损失。

腺病毒、溶瘤病毒和其他病毒载体

腺病毒是一种无包膜病毒载体，传统上用于疫苗研发，如一些 COVID-19 疫苗 (26)。与 AAV 和 LV 不同的是，腺病毒的产生需要通过感染而非转染来扩增病毒。悬浮和贴壁系统均可用于腺病毒生产，但 iCELLis 生物反应器能够快速从小规模贴壁系统放大，这也适用于腺病毒生产。如表 6 所示，使用 iCELLis Nano 生物反应器时，腺病毒收率的范围为 7.0 × 10⁷–1.36 × 10¹⁰ IFU/cm²；然而，在使用 iCELLis 500 生物反应器的 66 m2 填充床进行优化和放大过程中，报告收率为 1.57 × 10¹⁰ IFU/cm²。这些结果表明，iCELLis 生物反应器在腺病毒生产中实现了可放大性且一致的结果。

除 LV 外的其他重组逆转录病毒载体也作为病毒载体进行了研究。典型的逆转录病毒载体生产使用稳定的生产细胞系。Wang 等人 (2013) 表明，两种生产细胞系 293GP 和 PG13 在 iCELLis 生物反应器中正常生长，病毒产量比对照平板高 6-10 倍。

溶瘤病毒在基因转移机制上可视为与病毒载体类似，与基因治疗载体一样，iCELLis 生物反应器中也有多个生产实例，如表 6 所示。这些出版物 (Correia et al.，2019; Sable et al.，2020; Wohlfarth et al.，2021) (25，26，27) 表明，iCELLis 生物反应器中的溶瘤病毒产量与平底培养皿工艺相当或更高。

表 6.文献中发表的其他基因治疗载体和溶瘤病毒的生产力

产品	细胞系	生物反应器 尺寸 (m2)	产品收率	对照	来源
腺病毒	A549	2.65	41.1 × 1010 TCID50/cm2	-	Knowles et al. 2013 (27)
腺病毒	HEK293	0.8, 2.67, 4, 100, 500	6.1 × 109 IU/cm2	4.0 × 109 IU/cm2（方瓶）	Lesch et al. 2015 (28)
腺病毒载体	HEK293	2.65, 66	1.6 × 1010 IFU/cm2	1.6 × 109 IFU/cm2（多层罐体）	Legmann et al. 2017 (29)
腺病毒	HEK293	0.53	7.0 × 107 vp/cm2 8.1 × 105 IFU/cm2	3.2 × 107 vp/cm2 3.2 × 105 IFU/cm2 (多层罐体)	Yakshe et al. 2018 (30)
腺病毒	293T, HEK293	-	8.53 × 1010 vp/mL	-	Leinonen et al. 2019 (18)
腺病毒 (Ad5)	HEK293	0.53–4, 66	9.91 × 109 IFU/cm2	1.6 × 109 IFU/cm2	Cytiva 和 Orgenesis 2019 (31)
逆转录病毒	293GP*	2.65	4 × 106 TU/mL	1.8 × 106 TU/mL (多层罐体)	Wang et al. 2013 (32)
逆转录病毒	PG13*	2.65	1.83 × 106 TU/mL	0.57 × 106 TU/mL (多层罐体)	Wang et al. 2013 (32)
溶瘤病毒载体	Vero	0.53–4	(仅表达)	-	Correia et al. 2019 (33)
溶瘤病毒	MRC-5	2.65, 4	200%–400% (平底培养皿)	100% (多层罐体)	Sable et al. 2020 (34)
H-1 原细小病毒	NB-324 K	0.53, 4	5.7 × 106 PFU/cm2	2.0 × 107 PFU/cm2 (方瓶)	Wohlfarth et al. 2021 (35)

*生产细胞系

 

疫苗、重组蛋白和外泌体

由于 iCELLis 生物反应器技术适用于贴壁细胞培养过程，具有良好的可放大性，因此除了基因治疗载体外，还有其他多种应用示例。本文总结了其他应用，包括疫苗、重组蛋白和外泌体生产。

病毒疫苗生产

疫苗生产在生物药品制造中有着悠久历史，并且已经建立了成熟的传统平底培养皿工艺流程。然而，即使在这些工艺中，iCELLis 生物反应器也能为现代生产工艺提供更可控、更节省空间的环境。如表 7 所示，使用成熟的贴壁细胞系（如 Vero 细胞）生产的各种病毒疫苗产品，其细胞生长和病毒产生与传统平底培养皿工艺相当。这些结果表明，iCELLis 生物反应器可作为使用贴壁细胞培养工艺生产各种疫苗的替代方案。

表 7.文献中发表的病毒疫苗生产力

产品	细胞系	生物反应器 尺寸(m2)	产品收率	对照	来源
痘病毒（改良型安卡拉痘苗病毒）	CEF	0.7*	3.5 × 106 PFU/cm2	8.5 × 106 PFU/cm2 (多层罐体)	Havelange et al. 2009 (36)
副粘病毒	Vero	0.7*	6.4 × 105 TCID50	-	Knowles et al. 2013 (27)
牛疱疹病毒	MDBK（Madin-Darby 牛肾）	4	1.9 × 107 PFU/cm2	-	Lennaertz et al. 2013 (3)
流感病毒	Vero	4	-	-	Lennaertz et al. 2013 (3)
乙型流感病毒	MDCK（Madin-Darby 犬肾）	0.53	1.7 × 109 PFU/cm2 （通过 HA 检测估算）	1.5 × 109 PFU/cm2 (多层罐体)	Yakshe et al. 2018 (30)
基孔肯雅病毒	MRC-5	4	2 × 106–3.2 × 107 PFU/mL	2.8 × 104 –2 × 106 PFU/mL (滚瓶)	Rajendran et al. 2014 (37)
甲型肝炎病毒	MRC-5	4	-	-	Rajendran et al. 2014 (37)
狂犬病病毒	Vero	4	1.8 × 109 TCID50/mL	1.2 × 109 TCID50/mL (滚瓶)	Rajendran et al. 2014 (37)
狂犬病病毒	Vero	0.53	6 × 107 LD50/mL	2.7 × 107 LD50/mL (滚瓶)	Becheau et al. 2020 (38)
轮状病毒	Vero	-	7.0 ± 0.2 × 1010 FFU/mL	7.3 ± 0.3 × 1010 FFU/mL (多层罐体)	Hamidi et al. 2021 (39)

*iCELLis 生物反应器的试点版本

 

蛋白质和外泌体生产

iCELLis 技术在其他基于细胞的工艺中也展现出其应用价值。如表 8 所示，这些工艺包括用于蛋白质生产的 CHO 细胞系和昆虫细胞系 (40，41)，通常在悬浮细胞培养体系中进行。这些结果表明，iCELLis 技术适用于多种类型的细胞，通常包括在搅拌罐生物反应器中需要高氧供应和悬浮环境的细胞。

另一有趣的应用是外泌体生产。外泌体是由细胞分泌的小型细胞外囊泡，目前正在研究其生物活性和作为药物递送系统的效力 (42)。因对环境变化敏感，干细胞产生外泌体通常在贴壁环境中进行。iCELLis 生物反应器可以为生产规模工艺提供温和的贴壁环境和较大的表面积，最近 Haylock 等人(2022) (43) 报告称，iCELLis 生物反应器中的外泌体产量与预期相当。（采用 iCELLis 技术的外泌体应用数量仍然有限。如对工艺开发感兴趣，请联系您的 FAS 代表）

表 8.文献中发表的蛋白质和外泌体生产力

产品	细胞系	生物反应器 尺寸 (m2)	产品收率	对照	来源
mAb	rCHO	-	4 g/L/day	-	Drugmand et al. 2009 (29)
rVGP*	S2	4	2.5 μg/107细胞 (0.14 μg/cm2)	1.9 μg/107细胞 (搅拌罐)	Ventini-Monteiro et al. 2015 (41)
rVGP*	SF9	4	-	-	Ventini-Monteiro et al. 2015 (41)
外泌体	GT1-7	0.53	2.4–5.0 × 105颗粒/mL	-	Haylock et al. 2022 (43)
外泌体	iMSC	0.53	7 × 105颗粒/细胞	1 × 104颗粒/细胞	Vakil et al. 2022 (44)

*rVGP：狂犬病病毒糖蛋白。

 

结论

本文总结了 iCELLis 生物反应器中各种工艺的实例。其中主要应用之一是基因治疗载体的生产。在 AAV 工艺中，该生物反应器无论血清型如何均表现出较高的生产效率，并已经用于基因治疗药物的商业化生产。对于 LV 生产，iCELLis 生物反应器固有的灌注能力可最大限度地减少 LV 载体暴露于剪切力或高温条件，从而与补料分批工艺相比提高了收率。除病毒载体生产外，iCELLis 生物反应器还具有日益多样化的应用，包括疫苗生产、溶瘤病毒生产，并最近扩展至外泌体生产。iCELLis 生物反应器在各种产品中的广泛应用以及从现有贴壁细胞培养工艺中轻松转移工艺的能力，显示了其多功能性和进一步潜力。

致谢

本文综述由 Cytiva 现场应用专家团队的 Federico Saltarin、Letícia Parizotto、Zi Ying Tan 和 Kohei Natori 编写。

参考文献

 

1. T. Tanaka, H. Hanaoka and S. Sakurai, Optimization of the quality by design approach for gene therapy products: A case study for adeno-associated viral vectors., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, vol. 155, pp. 88-102, 2020. doi:10.1016/j.ejpb.2020.08.002
2. R. Legmann, F. Collard and A. Nyamay’Antu, Viral vector manufacturing and transfection efficiency in the iCELLis® Bioreactor system, Cell & Gene Therapy Insights, vol. 6, no. 10, p. 1573–1585, 2020. doi:10.18609/ cgti.2020.174
3. A. Lennaertz, S. Knowles, J. C. Drugmand and J. Castillo, Viral vector production in the integrity® iCELLis® singleuse fixed-bed bioreactor, from bench-scale to industrial scale, BMC Proceedings, vol. 7(Suppl. 6), p. 59, 2013. doi:10.1186/1753-6561-7-S6-P59
4. V. V. Emmerling, A. Pegel, E. G. Milian, A. VenereoSanchez, M. Kunz, J. Wegele, A. A. Kamen, S. Kochanek and M. Hoerer, Rational plasmid design and bioprocess optimization to enhance recombinant adenoassociated virus (AAV) productivity in mammalian cells, Biotechnology Journal, vol. 11, pp. 290-297, 2016. doi:10.1002/biot.201500176 associated virus (AAV) productivity in mammalian cells, Biotechnology Journal, vol. 11, pp. 290-297, 2016. doi:10.1002/biot.201500176
5. A. D. Powers, J. E. Drury, C. F. Hoehamer, T. D. Lockey and M. M. Meagher, Lentiviral Vector Production from a Stable Packaging Cell Line Using a Packed Bed Bioreactor, Molecular Therapy: Methods & Clinical Development, vol. 19, pp. 1–13, 2020. doi:10.1016/j. omtm.2020.08.010
6. P. Lefebvre, C. V. Huffel, O.-W. Merten, M. Hebben, C. Rousseaux, S. Arias, M. Hohoud, R. Lievrouw, F. Moncaubeig, P. Nowicki and C. Cancian, Development of a Scalable Viral Vector Upstream Process for Gene Therapy: rAAV-8 Production by Transient Transfection of HEK-293 Cells in iCELLis® Bioreactor, the 25th Annual Meeting of the European Society for Animal Cell Technology (ESACT), 14-17 May 2017.
7. B. Kaspar, B. Gardell, K. Chung, D. Vallabhaneni and R. Legmann, Assessment of an Adherent HEK293 Cell Transfection Process for Scalable AAV Production in the iCELLis® 500 Fixed-Bed Bioreactors, Molecular Therapy, vol. 27, no. S1, pp. 226-227, 2019.
8. J. M. Escandell, D. A. Pais, S. B. Carvalho, K. Vincent, P. Gomes-Alves and P. M. Alves, Leveraging rAAV bioprocess understanding and next generation bioanalytics development, Current Opinion in Biotechnology, vol. 74, pp. 271–277, 2022. doi:10.1016/j. copbio.2021.12.009
9. A. D. Powers, B. A. Piras, R. K. Clark, T. D. Lockey and M. M. Meagher, Development and Optimization of AAV hFIX Particles by Transient Transfection in an iCELLis®FixedBed Bioreactor, Human Gene Therapy Methods, vol. 27, no. 3, pp. 112-121, 2016. doi:10.1089/hgtb.2016.021
10. S. Nass, B. Nambiar, M. Mattingly, D. Woodcock and C. O’Riordan, Evaluation of AAV vector production from the iCELLis fixed bed bioreactor vessel, Cell and Gene Therapy Insights, vol. 5, no. 11, p. 1461–1471, 2019. doi:10.18609/cgti.2019.154
11. R. Alfano, S. Pezoa, A. Pennybaker and N. Hazi, Application of Aber Biomass Probes to Inform Transfection Timing in Chemically Defined iCELLis® Bioreactor-Based Viral Vector Manufacturing, Cytiva, InVitria, 2021.
12. C. Illingworth, M. Duballet, J. Tordo, E. Arulmuthu, A. Lennaertz, J. Drugmand, J. Castillo and R. M. Linden, Adeno-Associated Virus Production Using a Disposable, Fixed-Bed Bioreactor: From Bench Scale to Industrial Scale, ADENOVIRUS VECTORS AND OTHER DNA VIRUS VECTORS I, vol. 22, no. 1, p. S33, 2014. doi:10.1016/ S1525-0016(16)35102-4
13. A. Pegel, J. Wegele, M. Kunz, C. Küppers, A. Schulze, A. Rößner, D. Kreß, F. Sonntag and M. Hörer, www. rentschler-biopharma.com, 2013. [Online]. Available: rentschler-biopharma.com/fileadmin/user_upload/ Scientific-Posters/14760_REN_POS_Wissen_ Poster_841x1189mm_4c_4_Ansicht.pdf.
14. 3 trends in lentivirus development and manufacturing, Genezen, [Online]. Available: genezen.com/insights/3- trends-in-lentivirus-development-and-manufacturing/. [Accessed 23 Jan. 2023].
15. A. McCarron, M. Donnelley, C. McIntyre and D. Parsons, Challenges of up-scaling lentivirus production and processing, Journal of Biotechnology, vol. 240, pp. 23–30, 2016. doi:10.1016/j.jbiotec.2016.10.016
16. A. J. Valkama, H. M. Leinonen, E. M. Lipponen, V. Turkki, J. Malinen, T. Heikura and S. Ylä-Herttuala, Optimization of lentiviral vector production for scale-up in fixedbed bioreactor, Gene Therapy, vol. 25, pp. 39-46, 2018. doi:10.1038/gt.2017.91
17. H. M. Leinonen, E. M. Lipponen, A. J. Valkama, H. Hynynen, I. Oruetxebarria, V. Turkki, V. Olsson, J. Kurkipuro, H. Samaranayake, A.-M. Määttä, N. R. Parker, S. Ylä-Herttuala and H. P. Lesch, Preclinical Proof-ofConcept, Analytical Development, and Commercial Scale Production of Lentiviral Vector in Adherent Cells, Molecular Therapy: Methods & Clinical Development, vol. 15, pp. 63-71, 2019. doi:10.1016/j.omtm.2019.08.006
18. H. M. Leinonen, S. Lepola, E. M. Lipponen, T. Heikura, T. Koponen, N. Parker, S. Ylä-Herttuala and H. P. Lesch, Benchmarking of Scale-X Bioreactor System in Lentiviral and Adenoviral Vector Production, Human Gene Therapy, vol. 31, no. 5-6, pp. 376-384, 2020. doi:10.1089/ hum.2019.247
19. P. Yoganathan, A. C. Lee, N. Hyatt, J. Bell, O. Becheau, T. Lundeen, S. Gupta and A. Laskowski, Perfusion Enables Increased Lentivirus Production using the iCELLis® Bioreactor System, Cytiva, Ottawa Hospital Research Institute, 2020.
20. S. Pezoa, R. Alfano, A. Pennybaker and N. Hazi, Efficient Lentiviral Vector Production in a Chemically Defined, Blood-Free and Serum-Free Medium, Scalable to the iCELLis® Bioreactor Technology, Cytiva, InVitria, 2021.
21. S. Pezoa, R. Alfano and N. Hazi, Evaluation of Transfection Reagents for High Titer Viral Vector Production in the iCELLis® Nano Bioreactor, Cytiva, InVitria, 2021.
22. I. Pelletier, V. Pasupuleti, P. Agnihotri, Y. Do, Z. Sandalon and K. Bayne, Scale up of a lentiviral production process from the iCELLis® Nano Bioreactor to the iCELLis 500+ Bioreactor, Cell & Gene Therapy Insights, vol. 7, no. 9, p. 1023, 2021. doi:10.18609/cgti.2021.134
23. Lentiviral Guide, Addgene, [Online]. Available: addgene. org/guides/lentivirus/#second-generation. [Accessed 23 Jan. 2023].
24. A. J. Valkama, I. Oruetxebarria, E. M. Lipponen, H. M. Leinonen, P. Käyhty, H. Hynynen, V. Turkki, J. Malinen, T. Miinalainen, T. Heikura, N. R. Parker, S. Ylä-Herttuala and H. P. Lesch, Development of Large-Scale Downstream Processing for Lentiviral Vectors, Molecular Therapy: Methods & Clinical Development, vol. 17, pp. 717-730, 2020. doi:10.1016/j.omtm.2020.03.025
25. C. R. Fiol, M.-L. Collignon, J. Welsh and Q. A. Rafiq, Optimizing and developing a scalable, chemically defined, animal component-free lentiviral vector production process in a fixed-bed bioreactor, Molecular Therapy—Methods & Clinical Development, vol. 30, no. 14, pp. 221–234, 2023. doi:10.1016/j.omtm.2023.06.011
26. A. Syyam, A. Nawaz, A. Ijaz, U. Sajjad, A. Fazil, S. Irfan, A. Muzaffar, M. Shahid, M. Idrees, K. Malik and S. Afzal, Adenovirus vector system: construction, history and therapeutic applications, Biotechniques, vol. 73, no. 6, 2022. doi:10.2144/btn-2022-0051
27. S. Knowles, J.-C. Drugmand, N. Vertommen and J. Castillo, Linear scalability of virus production in the integrity® iCELLis® single-use fixed-bed bioreactors from bench to industrial scale, BMC Proceedings, vol. 7, no. Suppl. 6, p. 60, 2013. doi:10.1186/1753-6561-7- S6-P60
28. H. P. Lesch, K. M. Heikkilä, E. M. Lipponen, P. Valonen, A. Müller, E. Räsänen, T. Tuunanen, M. M. Hassinen, N. Parker, M. Karhinen, R. Shaw and S. Ylä-Herttuala, Process Development of Adenoviral Vector Production in Fixed Bed Bioreactor: From Bench to Commercial Scale, Human Gene Therapy, vol. 26, no. 8, pp. 560 - 571, 2015. doi:10.1089/hum.2015.081
29. R. Legmann, A. Reniers, N. Kohlstrom, B. Gardell, T. Sanderson, L. Bradbury, J. Vicalvi, H. Mallory, F. Moncaubeig, V. Aviv, K. Shternhall-Ron, T. Itai, I. MeivarLevy and S. Ferber, Development and Optimization of Large Scale Production of Adenoviral Vector and Autologous Insulin Producing Cells Using iCELLis® 500 and Xpansion® 200 Single-Use Bioreactor, Cytotherapy, vol. 19, no. 5 Suppl., pp. S117-S118, 2017. doi:10.1016/j. jcyt.2017.02.189
30. K. Yakshe, E. D. Reyes, D. Mitchell, C. Sadowski and S. Pincus, Comparing Adherent-Cell Technologies: Amplification of Virus Stocks and Viral Vectors, BioProcess International, 2018.
31. Cytiva, Orgenesis, White Paper: An end-to-end process for large-scale adenovirus manufacturing for gene therapy, 2019. [Online].
32. X. Wang, M. Olzzewska, J. Qu, T. Wasielewska, S. Bartido, G. Hermetet, M. Sadelain and I. Riviere, Large-Scale Clinical-Grade Retroviral Vector Production in iCELLis Nano Bioreactor, Molecular Therapy, vol. 21, no. Suppl. 1, p. S21, 2013. doi:10.1016/S1525-0016(16)34385-4
33. A. Correia, K. Chung, D. Vallabhaneni, U. Dharmasiri, A. Baynham and R. Legmann, Oncolytic Virus Production in iCELLis® Bioreactor, Cytiva, 2019.
34. J. Sable, A. Alamgir, C. Daniels, N. Hazi, A. Laskowski and K. Bayne, Oncolytic virus production using MRC5 cells in Pall’s iCELLis nano bioreactor is equivalent in high and low compaction beds, 2020 ISPE Annual Meeting and Expo, 2020.
35. D. Wohlfarth, V. Frehtman, M. Müller, M. Vogel, L. M. P. Phan, A. Brunecker and B. Leuchs , Upstream process optimization and micro- and macrocarrier screening for large-scale production of the oncolytic H-1 protoparvovirus, Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 105, no. 24, pp. 9113–9124, 2021. doi:10.1007/s00253-021-11642-y
36. N. Havelange, M. Marigliano, M. Sainte-Marie, F. Debras, N. Tazir and J. Castillo, Poxvirus Production on Chicken Embryo Fibroblasts in iCELLis™ Disposable Fixed-Bed Bioreactor, the 21st Annual Meeting of the European Society for Animal Cell Technology (ESACT), 7–10 June 2009. doi:10.1007/978-94-007-0884-6_114
37. R. Rajendran, R. Lingala, S. K. Vuppu, B. O. Bandi, E. Manickam, S. R. Macherla, S. Dubois, N. Havelange and K. Maithal, Assessment of packed bed bioreactor systems in the production of viral vaccines, AMB Express., vol. 4, p. 25, 2014. doi:10.1186/s13568-014- 0025-z
38. O. Becheau, J. Groba and T. Lundeen, The iCELLis® Nano Bioreactor Provides a Reliable Method to Produce Rabies Vaccines With High Titer and High Potency, Cytiva, São Paulo University, 2020.
39. A. Hamidi, F. Hoeksema, P. Velthof , A. Lemckert, G. Gillissen, A. Luitjens, J. E. Bines , S. R. Pullagurla, P. Kumar, D. B. Volkin , S. B. Joshi, M. Havenga, W. A. Bakker and C. Yallop, Developing a manufacturing process to deliver a cost effective and stable liquid human rotavirus vaccine, Vaccine, vol. 39, no. 15, pp. 2048–2059, 2021. doi:10.1016/j.vaccine.2021.03.033
40. J.-C. Drugmand, N. Havelange, F. Collignon, J. Castillo and P. -A. Girod, 4 g/L.day: Monoclonal Antibody Volumetric Productivity in the iCELLis™ Disposable Fixed-Bed Bioreactor, the 21st Annual Meeting of the European Society for Animal Cell Technology (ESACT), 7–10 June 2009. doi: 10.1007/978-94-007-0884-6_60
41. D. Ventini-Monteiroa, S. Duboisc, R. M. Astray, J. Castillo and C. A. Pereira, Insect cell entrapment, growth and recovering using a single-use fixed-bed bioreactor. Scaling up and recombinant protein production, The Journal of Biotechnology, vol. 216, pp. 110-115, 2015. doi:10.1016/j.jbiotec.2015.10.013
42. Y. Zhang, J. Bi, J. Huang, Y. Tang, S. Du and P. Li, Exosome: A Review of Its Classification, Isolation Techniques, Storage, Diagnostic and Targeted Therapy Applications, International Journal of Nanomedicine, vol. 22, no. 15, pp. 6917–6934, 2020. doi:10.2147/ijn.s264498
43. D. Haylock, T. Tay and S. Choe, Exosome Manufacture Using the iCELLis® Single-Use Fixed-Bed Bioreactor Platform, Cytiva, 2022.
44. D. Vakil, F. Mckinnirey, K. Natori and K. Sidhu, The Scale up Production of Exosomes Using a 3D Fixed Bed Bioreactor with IPSC Derivered Induced Mesenchymal Stem Cells, Sydney Australia: CK Cell Technologies Pty. Ltd., Cytiva, 2022.