为什么要实现纯化工艺的自动化？
通过优化细胞培养条件或克隆选择过程生成大量样本，可能会导致工作负荷过重和工作能力受限。使用自动化无需手动单独设置每个层析步骤，从而腾出时间执行其他任务。您将节省时间用于数据分析，并实现更高通量，而无需在实验室花费更多时间。
自动化优势：
- 通量更高
- 高效利用资源
- 腾出时间执行其他任务
平行自动纯化多种蛋白质
我们创建了解决方案，可自动平行运行多个样本。连接最多三台 ÄKTA go™ 层析系统，并使用同一个计算机屏幕控制整个过程（图 1）。完整的解决方案使您能够平行纯化 15 个样本。仅使用一个显示器来控制纯化，可以节省空间。每个系统都需要一台带有 UNICORN™ 客户端的单独 PC 以运行仪器服务器。PC 可轻松安装在系统背面，以最大限度地减少占用空间。
ÄKTA go 系统占地面积小，再加上放置在系统下方的组分收集器 F9-T，可节省宝贵的实验台或冷柜空间。
UNICORN 软件工具箱中的 My Instrument（我的仪器）和 UNICORN 在线功能显示了工艺概述，即使您不在系统前，也能控制和与系统交互。
图 1多个 ÄKTA go 系统可通过一台计算机连接和控制。为节省空间，可使用具有单独 UNICORN 许可证的微型或台式 PC，为设置中的每个系统运行仪器服务器。
为何需要多个步骤来纯化目标分子？
纯化方案通常面临两个因素的挑战：
- 在不导致样本质量下降的情况下尽可能多地捕获目标分子。
- 去除杂质、不需要的异构体并最大程度减少聚集体含量
为了捕获目标分子，最好使用亲和层析步骤 (AC)。该步骤可将该分子从初始样本（例如血清、细胞培养液）中分离出来，并通常能达到高纯度水平。然而，目标分子可能未处于最佳状态，因此需要引入第二个步骤以维持分子稳定性。
根据目标分子的不同，可选择不同技术解决去除不需要分子的难题。例如，抗体可能需要去除抗体聚集体和/或片段以获得单体抗体。此时建议采用尺寸排阻层析法 (SEC) 步骤。对于腺相关病毒 (AAV) 纯化方案，亲和步骤之后可进行离子交换层析 (IEX) 步骤，以区分空衣壳和完整衣壳。
如何设置自动两步法纯化运行？
设置自动两步法纯化运行并不困难。只需将方法排队，处理中间峰，并允许系统和软件从头到尾运行，即可实现自动多步骤纯化。通过利用 UNICORN 软件中的 Method Queue（方法队列），可添加步骤并按顺序运行。
ÄKTA go 峰收集管提供了一种标准化解决方案，可将层析过程中的峰定向引导至临时储存容器，实现两个纯化步骤间的中间储存。在两步法纯化运行中，使用 UNICORN 软件中的 Peak to loop（峰引入环路）功能，将中间峰定向收集至连接在进样阀的管道中。您可以离开系统去执行其他任务，待两个净化步骤完成并且收集到的组分已准备就绪后返回继续进行下一步。
示例：细胞培养批次的自动化两步法纯化流程
ÄKTA go 系统是一种小型且紧凑的液相层析系统，可使您轻松执行常规蛋白纯化，同时可有效使用工作台和冷柜空间。
在此方法中，我们在平行生物反应器中以不同条件培养 CHO 细胞，以展示自动纯化的概念验证。该生物反应器可产生 12 个细胞培养批次，每个批次 250 mL。这将产生多个待纯化的样本，并使工作流程瓶颈推至流程的下一步。如何以优化时间和资源的方式高效纯化所有样本？我们使用 ÄKTA go 系统设置了自动两步法流程。
亲和步骤使用 HiTrap™ MabSelect SuRe™、1 mL 层析柱进行，并使用 HiPrep™ 26/10 脱盐柱进行尺寸排阻。使用具有 5 个层析柱位置的 V9-C 柱阀，将两个层析柱同时连接至系统，并使用 ÄKTA go 峰收集管进行中间峰收集（图 2）。
图 2ÄKTA go 系统正在配置并准备执行自动两步法纯化运行。ÄKTA go 峰收集管套件正在连接至进样阀位置 Syr。
利用预定义方法简化了纯化过程
ÄKTA go 系统由 UNICORN 软件全面支持，可实现对层析系统的实时控制。对于最常见的层析技术，可通过预定义方法在几分钟内创建自动化方法。在此应用中，使用预定义方法生成以下方法（图 3）。
图 3UNICORN 软件中亲和层析和尺寸排阻层析法（脱盐）步骤的预定义方法。
我们使用了 UNICORN 软件中的 Method Queue（方法队列）功能，自动将各个方法连接在一起并按顺序运行（图 4）。
图 4方法队列在 UNICORN 的 Method Editor（方法编辑器）中设置，可用于自动按顺序运行两种方法。
对 ÄKTA go 系统进行设置，通过洗脱阶段的 Fractionate（组分）部分中的 Peak to loop（峰引入环路）选项，将峰从亲和步骤引导至尺寸排阻步骤（图 5）。此设置在 Affinity method（亲和方法）中完成。在尺寸排阻法中，在 Sample Application（样本加载）阶段选择 Reinject counted volume（定量体积再注入），以自动将收集的峰作为样本加载至第二个纯化步骤中（图 6）。
图 5为了从第一步纯化中收集中间峰，在 UNICORN 软件中选择 Peak to loop（峰引入环路）功能。
图 6为了将收集到的峰作为样本加载到第二个纯化步骤中，在 Sample Application（样本加载）阶段选择 Reinject counted volume（定量体积再注入）。
结果
在 pH 3.5 的洗脱阶段，目标蛋白质在均匀的峰中洗脱。层析图谱中设置了标记来指示 ÄKTA go 系统何时开始将样本收集到试管中以及何时停止（图 7）。
亲和纯化的样本自动加载至 SEC 柱上，并如预期在 1.6 分钟处以干净的峰洗脱，对应于 mAb 的单体大小 (150 kDa)（图 8）。
根据峰面积计算，两步之间的收率为 98%（表 1）。
图 7层析图谱显示了亲和层析步骤的结果
图 8层析图谱显示了尺寸排阻层析步骤的结果
| 方法 1：亲和峰面积 (mL xmAU)，纯化样本 |
方法 2：SEC 峰面积 (mL x mAU) | 收率 |
| 1618 | 1586 | 98% |
表 1根据层析图谱分析的曲线下面积计算收率。
使用 ÄKTA go 系统进行自动化纯化的技巧
ÄKTA go 系统的默认配置包含 V9-O 出口阀，带废液口、组分收集器和一个出口位置。当您想要在纯化运行期间收集流穿液时，我们建议将其更换为带 10 个出口位置的 V9-O 出口阀（货号 29012261）（图 9）。
图 9可选择 10 个出口位置的 V9-O 出口阀，配置到 ÄKTA go 系统。
总结和结论
- 我们已实现最多三个 ÄKTA go 系统的平行纯化，使用户能够在节省宝贵的实验室台和冷柜空间的同时，纯化最多 15 个样本。
- 通过引入“峰引入环路”功能并利用 UNICORN 软件中的用户友好特性，ÄKTA go 系统现可运行自动两步法纯化。
- 对于以 CHO 细胞表达的 mAb，我们通过运行由亲和步骤和脱盐缓冲液交换步骤组成的自动两步法纯化，确认了易用性和概念验证。
无论是纯化抗体还是其他目的分子，ÄKTA go 系统都是直接从细胞培养物中纯化蛋白质的可靠而有效的选择。
其他资源：
两步层析法用于 Fab 高效纯化，https://www.cytiva.com/solutions/bioprocessing/knowledge-center/akta-go-protein-purification-system-for-fab-purification
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