如何使用经验证的方法装填 Cytiva™ Protein Select™ 填料
Cytiva™ Protein Select™ 填料是一种亲和层析填料，用于通过 Cytiva™ Protein Select™ 标签纯化重组蛋白。在使用该填料进行亲和层析步骤时，蛋白可从标签上自我裂解并洗脱，不会残留标签氨基酸。该技术用于在研究中简化标签蛋白质的纯化。对于缺乏亲和配基的蛋白纯化，该技术可实现其工艺开发及生产的标准化。该填料基于高流速的琼脂糖，可在生物工艺中提供优异的分离度。
您可以将 Cytiva™ Protein Select™ 填料装填至AxiChrom™ 层析柱中，以获得高流速，并提高您的工艺设计的生产力和灵活性。为了实现有效的纯化，您需要确保以高效的方式装填填料。层析柱装填不当可能会导致造成严重损失的工艺中断，并可能会损坏宝贵的产品。采用稳健且经验证的装填和测试方法可消除此类问题和风险。
本文将介绍装填 Cytiva™ Protein Select™ 填料到 AxiChrom™ 层析柱的最佳实践，帮助您高效完成装填操作。
Cytiva™ Protein Select™ 层析填料特性
Cytiva™ Protein Select™填料采用成熟的高流速琼脂糖基架，具备优异的压力/流速特性。刚性基质支持重组蛋白纯化工艺中的较高流速。较高的物理和化学稳定性对于提升大规模操作的生产效率至关重要。该配基在大肠杆菌中表达。发酵和后续纯化无需使用动物源性成分。
Cytiva™ Protein Select™ 填料的平均粒径为 60 μm。建议尽快进行上样和清洗（即采用高流速），以尽可能减少裂解蛋白在此过程中的损失。然而，对于裂解速度较慢的蛋白，可在上述步骤中适当降低流速。在 AxiChrom™ 层析柱中，10 cm 柱床高度（20°C，20% 乙醇）条件下，流速性能可达 520 cm/h，背压低于 0.3 MPa（3 bar，43.5 psi）。20% 乙醇的粘度与大肠杆菌裂解物的粘度相近，可模拟具有类似压力流速曲线的样品。在放大工艺时，应确保所选柱床高度和流速不超过大型层析柱的压力/流速限制。
Cytiva™ Protein Select™ 填料在各种装填溶液中的性能
Cytiva™ Protein Select™ 填料在用于填装的水、20% 乙醇和盐溶液中可快速沉降。当您使用这些溶液时，请记住在装填后立即冲洗管路和滴头，以防止流路堵塞。
向装填溶液中添加盐会减慢填料磁珠的沉降速度，并使填料沉降后不至于太过紧密。因此，使用含盐溶液时很难通过重力测量浆液浓度。然而，通过下面描述的浆液浓度测定方法，可快速准确地测定浆液浓度。
例如，在 60 cm/h 的沉降速率下，与水相比，Cytiva™ Protein Select™ 填料在盐溶液中的固结柱床高度可高出最多 4%，在 20% 乙醇中可高出最多 0.5%。可以通过使用不同的装填系数 (PF) 来补偿这种效应。然而，为了实现填充床的优质性能，我们推荐使用 0.15 M NaCl 作为装填溶液，本文将对此进行进一步说明。
装填的基本考虑因素
定义
由于填料在不同条件下具有不同的特性和表现，重力沉降柱床的高度与低流速下沉降柱床（固结）的高度不同。因此，您应区分压缩系数 (CF) 与 PF（方程 1 和 2）。例如，使用 0.15 M NaCl 将填料装入 AxiChrom™ 50-200 mm 层析柱，在 60 cm/h 的条件下进行固结，PF 为 1.28，CF 为 1.32。
计算 CF、PF 和柱体积 (CV) 的方程式如下所示：
方程 1:
压缩系数, CF = L沉降 / L装填
方程 2:
装填系数, PF = L固结 / L装填
其中
L沉降 = 重力沉降后测得的柱床高度
L固结 = 在给定流速下填料沉降后测得的柱床高度
L装填 = 装填后的柱床高度
CV = L装填 × AC
其中
AC = 层析柱横截面积
在装填 AxiChrom™ 层析柱时，在装填过程中使用 PF 计算固结步骤后的最终装填柱床高度。在层析填料制备步骤中使用 CF 计算装填目标柱床高度所需的填料体积。
浆液制备
Cytiva™ Protein Select™ 填料以 20% 乙醇形式提供。装填前，按照您要装填的层析柱的说明所述，将填料转移到装填溶液中。
可通过摇动/搅拌手动制备或使用混合器（例如Media Wand™ 浆液混合和转移工具）制备填料，以形成浆液。虽然摇动可产生良好效果，但在体积较大时该操作通常并不实用。搅拌时，最好使用没有锋利边缘的软质搅拌器。Media Wand™ 将填料直接混悬于容器中，通过一步操作将浆液转移至BioProcess™ 填料匀浆罐 中，因此适用于大规模装填。
为了获得正确数量的层析填料以装填到目标柱床高度或压缩，必须正确测量浆液浓度，这一点很重要。当您制备浆液时，首先计算装填至目标柱床高度所需的层析填料体积 (V)。您可以通过多种方式测定浆液浓度，但要获得 Cytiva™ Protein Select™ 填料的准确浆液浓度，我们推荐使用浆液浓度套件, 其中包含测定浆液浓度所需的所有材料。
在 AXICHROM™ 层析柱中装填 CYTIVA™ PROTEIN SELECT™ 填料
AxiChrom™ 层析柱是低压机械轴向压缩层析柱，设计用于工艺开发和生物制药生产环境。即使在使用大直径层析柱的情况下，机械轴向压缩也可以对装填进行准确且可重现的控制。
智能装填功能使层析柱操作简便，并为您提供非常高的装填成功率。本文所述的装填方法适用于柱床高度为 10 cm 的应用场景。
装填 AxiChrom™ 50 至 200 mm 层析柱用于 ÄKTA™ 层析系统时，智能装填控制由 UNICORN™ 控制软件来管理。对于 AxiChrom™ 300 至 1600 mm 层析柱，智能装填功能由 AxiChrom™ 层析柱控制器执行，这是一个独立的装置，包含一个通过触摸屏操作的用户界面，也可以通过ÄKTA process™ 层析仪系统上的 UNICORN™ 控制软件进行操作。
AxiChrom™ 层析柱智能装填 — 一般考虑因素
创建装填方法时，需要在智能装填向导中输入装填变量，例如填料、浆液浓度和目标柱床高度。
请与您的 Cytiva 代表联系，以获取有关自动 AxiChrom™ 层析柱功能的更多信息。
在 AxiChrom™ 层析柱中装填 Cytiva™ Protein Select™ 填料的特定考虑因素
AxiChrom™ 层析柱中适用于 Cytiva™ Protein Select™ 填料的一般柱床高度为 10 cm。装填变量和推荐的装填缓冲液见表 1。如果装填柱直径超过 300 mm，请联系您的 Cytiva 代表。
表 1. 在 AxiChrom™ 100 和 300 层析柱中装填 Cytiva™ Protein Select™ 填料的装填变量
| 装填变量 | AxiChrom™ 100 和 AxiChrom™ 300 层析柱 |
| 装填溶液 | 0.15 M NaCl |
| 装填流速 | 60 cm/h |
| 装填系数 | 1.28 |
使用 ÄKTA™ process™ 层析系统进行 Cytiva™ Protein Select™ 填料的装填与拆柱
通过ÄKTA process™ 层析系统向 AxiChrom™ 300 层析柱装填 Cytiva™ Protein Select™ 填料时，可使用 UNICORN™ 中的 Intelligent Packing（智能装填）向导。应用该向导时，会自动应用正确的装填变量（如 PF 和接头速度）。
测试装填层析柱的性能
生产级装填柱必须在多个处理周期内均具有很高的效率（即表现出极高稳定性）。装填柱的效率可以用理论塔板高度 (HETP) 和不对称性系数 (AS) 来表示。应定期重复效率测试以在整个层析柱的工作寿命中监控填充床状态。为确保测试结果长期保持稳定，流速 (cm/h)、液体通道、样品组成和洗脱缓冲液等条件应保持恒定。
为了比较装填有不同粒径层析填料的层析柱性能，通常采用约化塔板高度（h = HETP/平均粒径 [dp]）。作为准则，h < 3="" />
本研究中使用的测试条件
样品: 2% v/v 丙酮水溶液
样品体积: 柱体积 (CV) 的 1%
流速: 30 cm/h
洗脱液: 水
AXICHROM™ 层析柱的结果
用上述方法装填后，测试了层析柱的板数、不对称性、压力流速和稳定性。
表 2 显示了在 AxiChrom™ 100 与 AxiChrom™ 300 层析柱中装填 Cytiva™ Protein Select™ 填料后所获得的效率范围与稳定性结果。图 1 显示了 AxiChrom™ 100 和 300 层析柱的压力流速曲线。
图 2 展示了 HiScale™ 层析柱在缩小研究中获得的压力流速曲线。在从小规格层析柱放大至 AxiChrom™ 层析柱时，应确保选定的柱床高度和流速不超出 AxiChrom™ 层析柱的压力/流速限制。对于小规模层析柱的压力/流速曲线，参见使用说明 29711002。
表 2. Cytiva™ Protein Select™ 填料在 AxiChrom™ 100 和 AxiChrom™ 300 层析柱中的装填结果
| 层析柱 | 柱床高度 (cm) | 平均值 N/m* | 约化塔板高度 (h) 范围 * | 不对称系数(As)范围* |
稳定性测试的流速 (cm/h)† |
稳定性测试后的变化(%)† | |
| h | As | ||||||
| AxiChrom™ 100 | 10 | 9800 | 1.6 至 1.8 | 1.0 至 1.1 |
660 | 7 | 6 |
| AxiChrom™ 300 | 10 | 9500 | 1.6 to 1.7 |
1.2 to 1.3 |
640 | -3 | 7 |
† 稳定性测试在 20% 乙醇中以给定流速进行，持续时长为 16 小时。
* 在理想测试条件下进行。至少三次装填的上下流速测试的平均值和范围。
图 1. Cytiva™ Protein Select™ 填料在 AxiChrom™ 100 和 300 层析柱中的压力流速曲线，归一化至 10 cm 柱床高度、20°C 条件。1 bar = 0.1 MPa = 14.5 psi（20% 乙醇用于模拟样品，即具有与大肠杆菌裂解物相似的粘度）
图 2. 含 20% 乙醇的 Cytiva™ Protein Select™ 填料在 HiScale™ 层析柱（10 cm 柱床高度）中的压力流速曲线。1 bar = 0.1 MPa = 14.5 psi（20% 乙醇用于模拟样品，即具有与大肠杆菌裂解物相似的粘度）
结论
为充分利用 Cytiva™ Protein Select™ 填料的流速潜力，我们建议在您的工艺中使用 AxiChrom™ 层析柱。我们描述了使用智能装填定制模式功能在 AxiChrom™ 层析柱中装填 Cytiva™ Protein Select™ 填料的情况。我们还描述了与特定装填溶液相关的每种装填方法。偏离所描述的装填溶液的使用方法可能会对 PF 造成显著影响，且后续还会对装填结果造成显著影响。装填结果和柱床性能完全符合装填良好的柱床的正常验收标准，并可确保提供可靠和稳定的工艺性能。
相关资源
- AxiChrom™ 300 至 1600 mm 层析柱产品页面
- AxiChrom™ 50 至 200 mm 层析柱产品页面
- • 工艺规模层析柱装填资源
- Cytiva™ Protein Select™ 技术常见问题解答
- Cytiva™ Protein Select™ 填料数据文件
- Cytiva™ Protein Select™标签序列
- Cytiva™ Protein Select™ 填料及 HiTrap™ Protein Select™ 层析柱产品页面
- Cytiva™ Protein Select™ 填料使用说明
- HiTrap™ Protein Select™ 层析柱使用说明