基于 RNA 的疫苗因其用途广泛和具有预防多种病毒和非病毒病原体的潜力而受到越来越多的关注。自扩增 RNA (saRNA) 疫苗具有与信使 (mRNA) 疫苗相同的关键优势（例如开发快、模块化设计和无细胞合成），同时还具有额外的好处。这些制剂的自我复制特性可长期保持对疾病的疗效，从而降低总剂量需求。由于在不同人群中提供相同水平的保护所需的 RNA 较少，因此生产负担减轻，使生产设施可生产的 saRNA 是 mRNA 的 100 倍，从而降低了生产成本并缩短了生产时间。因此，一旦发生疫情，就可以实现分布式/分散式生产和快速大规模免疫接种。
开发基于 RNA 的药物或疫苗面临的挑战
尝试成功开发 RNA 疫苗面临两大挑战：
- RNA 是带负电荷的大分子，需要载体才能进入细胞。
- RNA 很脆弱，在工艺开发、生产和/或制剂开发过程中很可能会迅速分解。
与许多其他小分子和生物药物不同，基于 saRNA 的疫苗等核酸治疗药物需要专门的递送技术。精心配制的载体有助于避免降解并保护有效载荷 cargo，确保其到达靶细胞后仍然有效。因此，系统筛选各种递送载体并选择合适的制剂是开发下一代 mRNA 疫苗的关键步骤。
脂质纳米颗粒技术有助于满足 saRNA 疫苗的递送需求
有效且高效的 saRNA 递送系统将核酸有效载荷凝缩到阳离子载体中，该载体可以进入细胞而不被降解。迄今为止，saRNA 的递送平台包括脂质纳米颗粒 (LNP)、聚合物复合物和阳离子纳米乳液（图 1）。
图 1. 非病毒 saRNA 递送系统
在所有递送平台中，随着最近 COVID-19 mRNA 疫苗获得美国 FDA 批准，LNP 在临床上获得了最多的关注。目前，saRNA 疫苗正在被研究用于防治疟疾和 COVID-19 等多种传染病，目前正在进行几项 saRNA LNP 疫苗临床试验。
脂质纳米颗粒方法递送基于 RNA 的疫苗具有以下优势：
- 在开发过程中保护 RNA cargo，直至其到达靶细胞。
- 增强抗原提呈细胞的吸收。
- 通过与内体膜相互作用从早期内体中释放 RNA cargo 的一种方法。
图 2. 基于脂质、聚合物和乳液的递送系统都使用阳离子基团来介导阴离子 RNA 的凝聚并进行跨细胞膜递送。LNP 系统利用对 pH 值敏感的可电离阳离子脂质作为主要成分，并通过受体介导的内吞作用被细胞吸收，是目前发现的最有效疫苗制剂。在内体中，较低的 pH 环境使阳离子脂质电离，然后阳离子脂质与内体膜中的阴离子脂质发生静电相互作用。这些离子对会导致相变，形成多孔六方相 (HII)，从而破坏内体并促进 RNA 释放到细胞质中。
了解 LNP 的形成和递送机制
在伦敦帝国理工学院开展的一项研究中，聚合物和脂质纳米颗粒被考虑用于递送自扩增 RNA 疫苗 (2)。研究人员使用通过 LNP 递送的编码融合前稳定 SARS-CoV-2 刺突蛋白的 saRNA 用于 COVID-19 疫苗，并使用血凝素 (HA) 糖蛋白用于流感疫苗。
Anna Blakney 博士是这项研究的第一作者，现担任不列颠哥伦比亚大学 (UBC) Michael Smith 实验室和生物医学工程学院助理教授，在伦敦帝国理工学院 Robin Shattock 教授和 Molly Stevens 教授的指导下，致力于开发用于递送自扩增 RNA 的分子和生物材料工程策略。
在此期间，Blakney 博士及其研究团队旨在更好地了解核酸递送制剂的成分如何与免疫系统相互作用以提高效力并实现临床转化。他们联系了 Replicate Biosciences 首席开发官 Andy Geall 博士和 Cytiva 研发总监 Anitha Thomas 博士，就如何尝试 RNA 配制方法、纳米颗粒表征方法和各种生化检测方法寻求指导。
Blakney 博士利用 NxGen™ 微流体仪器（用于脂质纳米颗粒形成），即 NanoAssemblr Ignite™ 系统开展了这项研究。Anitha Thomas 博士在 LNP 制剂方面拥有丰富的经验，她向研究团队提供了专有的 LNP 产品组合。他们的目标是选择特定应用的 LNP 组合物。通过研究，Blakney 博士及其团队了解了 LNP 如何充当 saRNA 疫苗的高效递送载体。
在发表于 Journal of Controlled Release 的研究中，研究人员广泛研究了脂质和给药途径（肌肉注射与鼻内注射）在疫苗递送中的作用 (2)。研究发现，这两个因素都会影响流感血凝素和 SARS-CoV-2 刺突蛋白的疫苗免疫原性。
研究人员比较了 saRNA 疫苗的两种递送载体，即脂质纳米颗粒和生物可还原聚合物 (pABOL)，特别是评估了蛋白质表达和免疫应答 (2)。对于 LNP 递送系统，制备了一种可电离脂质与两种辅助脂质的专有混合物，在乙醇中的总脂质浓度为 25 mM。虽然聚合物复合物制剂蛋白表达量更高，但 LNP 包裹的 saRNA 在两种疫苗模型（流感血凝素和 SARS-CoV-2 刺突糖蛋白）中均表现出更高的体液和细胞免疫力。
尽管 pABOL 聚合物复合物和 LNP 的大小相当，但在生理 pH 值下，pABOL 颗粒的表面电荷为净正电荷，而 LNP 制剂的表面电荷为中性 (2)。这一发现在预期之中，因为 LNP 中含有可电离阳离子脂质，这在 mRNA 和 saRNA LNP 制剂中很常见。研究人员得出结论，中性表面电荷可能会增加免疫原性，同时还发现辅助脂质会影响免疫原性。
在评估给药途径时，研究人员发现，肌肉内 (IM) 和鼻腔内 (IN) 给药均会产生全身抗体和粘膜抗体 (2)；但是，IM 给药途径产生的免疫应答要高出 10 倍。
上述发现表明，在基于 saRNA 或 mRNA 的疫苗领域，不同的递送系统和给药途径可能会填补不同的药物递送空白。总体而言，所有接种 LNP 制剂的小鼠组均表现出优异的细胞免疫力和反应原性。尽管在临床前阶段还需要进行更多的研究，但这些结果表明，采用 IM 和 IN 给药途径的 saRNA 制剂可引起急性、细胞因子驱动的反应原性，从而产生强有力的体液和细胞应答。
图 3. LNP- mRNA 疫苗的开发
这项研究强调了 LNP 递送载体和选择适当制剂的重要性，以确保治疗药物或疫苗在各种应用中均有效。LNPs 作为一种经过临床验证和可放大性技术，有可能成为未来的疫苗开发技术。广泛的研究和调查可以充分挖掘 LNP 递送 saRNA 疫苗的潜力，这些疫苗效率高、所需剂量低于 mRNA 制剂，而且可以快速生产疫苗。
REFERENCES
- Blakney, A.K.; Ip, S.; Geall, A.J. An Update on Self-Amplifying mRNA Vaccine Development. Vaccines 2021, 9, 97.
- Anna K. Blakney, Paul F. McKay, Kai Hu, Karnyart Samnuan, Nikita Jain, Andrew Brown, Anitha Thomas, Paul Rogers, Krunal Polra, Hadijatou Sallah, Jonathan Yeow, Yunqing Zhu, Molly M. Stevens, Andrew Geall, Robin J. Shattock. Polymeric and lipid nanoparticles for delivery of self-amplifying RNA vaccines. Journal of Controlled Release, Volume 338,2021, Pages 201-210.