用于扩大纳米颗粒生产的微流体装置

RNA 脂质纳米颗粒 (LNP) 的生产，例如 COVID-19 疫苗中使用的 LNP，需要将水性缓冲液中的 RNA 与溶于乙醇的脂质混合，以触发 LNP 的自组装。RNA 和脂质的混合条件至关重要，因为它们最终会影响产品质量。

在流体混合过程中，流体流动处于从湍流到层流的连续状态。在分子水平上，湍流条件高度随机且难以控制，例如用勺子搅拌茶水。在厨房里，湍流混合的随机性可能并不重要，但复杂和创新的药物递送纳米颗粒需要接受监管部门的审查，因此需要精密的生产控制。

微流体混合过程涉及溶剂分子、缓冲剂分子和至少五种化学类型分子之间复杂的分子间相互作用，这些相互作用会影响生成颗粒的物理特性。这些特征（例如颗粒度）会影响分子在体内的路径以及由此产生的免疫应答。因此，明确的颗粒特性对于确保药品的安全性和有效性至关重要。

微流体混合提供了非湍流条件，可以在几毫秒内实现流体的快速、可控和可重现混合，从而实现药物递送纳米颗粒的连续自组装。流体以微小规模进行操作，通常流经不同长度和几何形状的通道。

微流体混合具有以下优势，使其成为开发 RNA 疫苗 [1] 和其他药物递送技术的首选技术：

• 减少试剂消耗
• 可控的非湍流混合
• 可调节工艺参数以优化颗粒特性
• 占地面积小，可最大限度地减少对洁净室空间的要求
• 批次间可重现性

用于治疗药物递送的纳米颗粒制造的历史和演变

工艺和化学都会影响纳米颗粒的制造。早期用于小分子递送的脂基纳米颗粒（例如用于脂质体抗癌药物多柔比星的纳米颗粒）通过复杂的多步骤工作流程制造。该过程包括薄膜水合，然后进行高压均质化和超声处理或通过纳米多孔膜挤压。所得脂质体由脂质双分子层内的水性隔室组成。

在临床前研究中，脂质体历来被用于递送基因治疗药物。最初，这些分子的制造方法是先形成含有阳离子脂质的脂质体，然后将其与核酸混合，以促进静电复合。在发现阳离子脂质具有细胞毒性后，研究人员开始使用对 pH 值敏感的可电离脂质，这种脂质在生理 pH 值下不带电，从而提高了耐受性。

与此同时，研究人员还开发了第二代自下而上的自组装方法，将溶解在乙醇中的脂质与溶解在水性缓冲液中的核酸结合在一起。颗粒形成和核酸复合在一个步骤中完成，从而简化了生产，并使连续流形式更具可放大性。

通过将核酸封装在凝聚核心颗粒内，所得脂质纳米颗粒在结构上与脂质体不同 [2]。研究发现 LNP 的性能优于第一代脂质体 [3]，但是这种方法依赖于湍流的产生，而湍流的产生是通过在 T 型接头混合器等设备中高速混合水流和乙醇试剂流实现。随机分子碰撞控制混合，这需要大容量和高流速。因此，扩大或缩小工艺规模具有挑战性，需要进行大量的工艺重新开发工作。

与传统方法相比，微流体技术在纳米颗粒生产中的优势

纳米颗粒生产的第三代技术包括微流体交错人字形微混合器 (SHM) 混合器，它保留了连续流制造的优势，此外还可以更好地控制混合环境。非湍流流体混合可确保通过混合器的每体积液体的条件一致，从而实现批次内和批次之间的可重现性。

此外，还可以调整流速比 (FRR) 和总流速 (TFR) [4] 等工艺参数来调整所生产颗粒的理化特性，从而影响 LNP 药品的性能。在纳米药物生产中采用了多种微流体通道几何形状和结构，其中包括：

• NanoAssemblr™ 经典混合器：该设计通过改变流速和总流速比来产生尺寸控制的纳米颗粒。经典混合器已广泛应用于临床前开发，在 >500 篇同行评审出版物中被引用。但它也有一些局限性。该混合器需要以微小规模持续制造人字形结构，这导致工艺复杂且昂贵 [5]。Belliveau 等人描述的原始交错人字形微混合器设计为最佳运行速度为 5 mL/min，这已比其他微流体方案快一个数量级 [6]。SHM 设计得到了改进，采用了经典混合器，其运行速度高达 20 mL/min，这是在保持流动特性的同时 SHM 中可以达到的最高已知通量。这个容量足以在 4 小时内封装约 850 mg（毛重）的 mRNA，足以生产超过 28 000 剂疫苗。该工艺的主要瓶颈是下游切向流过滤。不过，如果需要，也可以通过并行化来横向扩大规模，以达到应用所需的更高通量。

• NanoAssemblr™ NxGen™ 混合器：这种新型混合器旨在简化单混合器的放大。通过在流道内使用圆形结构，可在非湍流条件下提供相当的混合效率以及更高的单混合器流速。NxGen™ 技术生产的颗粒与传统混合器生产的颗粒具有相同的关键质量属性 [5]，同时使单混合器流速达到 1 到 200 mL/min，高于 T 型接头混合的常见流速 [7]。以 200 mL/min 的流速下，单个 NxGen™ 混合器名义上在 4 小时运行中可封装 8.5 g mRNA（> 283 000 个疫苗剂量），是传统混合器容量的 10 倍。此外，Pfizer-BioNTech 对 COVID-19 疫苗进行的 III 期研究需要 44,000 剂，即约 1.32 g 封装的 mRNA [8] *。NxGen™ 技术可提供多种流速 [9]，非常适合临床前开发，并且无需改变技术即可转化为临床研究，从而最大限度地减少了工艺再开发和风险。

表 1. NanoAssemblr™ 经典混合器 (SHM)、NxGen™ 混合器（环形混合器 (TrM)）和 T 型接头混合器的比较。 †基于典型的 mRNA 制剂参数和每剂 30 μg mRNA 的疫苗剂量。不考虑工艺产量。

与传统制剂方法相比，非湍流混合具有优势，微小规模下的物理现象有助于促进：

• 尺寸均匀的纳米颗粒：通过非湍流混合，可以合成出高度均匀的纳米颗粒，其尺寸适合纳米应用（约 50 至 300 nm），从而可以控制流动和混合条件 [11]。

• 更好的药物装载效率和储存：尽管疏水药物可以被包裹在脂质体中，但由于在双分子层界面处被包裹，包裹效率通常较低。对此，Kastner 等人 [12] 利用混沌平流微混合器装置制造了脂质体，以溶解水溶性较差的药物丙泊酚。
• 最终得到的脂质体具有以下特点：
  • 包封的药物明显多于超声处理的脂质体
  • 表现出良好的稳定性，在 4 °C 和 25°C 下储存八周后仍不受影响

• 有望用于临床应用的递送结果：微流体保护核酸，有助于保持其稳定性。在一项使用基于微流体的核壳纳米颗粒的研究中，研究人员创建了一种新型脂质/聚合物混合纳米组装体，该组装体由小干扰 RNA (siRNA) 组成，其在反向聚 ɛ-己内酯-聚乙烯亚胺 (PCL-PEI) 胶束的内部亲水核心中复合，然后再包覆一层中性脂膜 [11]。与批量混合脂质/胶束/siRNA 纳米颗粒相比，微流体产生的核壳纳米结构能更有效地保护锁在核内的 siRNA，并提高其在循环中的稳定性。此外，这些纳米颗粒通过显著下调表皮生长因子受体 (EGFR) mRNA 和蛋白质体外和体内表达水平抑制了肿瘤生长。

• 脂质体从实验室到临床的转化：为了实现可放大性，Forbes 等人 [5] 使用 NanoAssemblr™ 经典混合器生产脂质体，同时加入胰岛素、牛血清白蛋白 (BSA) 或卵清蛋白 (OVA)，并使用 SHM 设备在线纯化和在线粒度监测进行过程控制。

• 主要结果：
  • 脂质体制剂可提供更高的蛋白质负载（20% 至 35%），而超声法或挤压法为 <5%。
  • 通过优化生产，产生了高负载脂质体，其大小可控（60 至 100 nm），多分散指数 (PDI) 为 < 0.2。

扩大纳米颗粒生产规模以供临床或工业使用

要在临床上广泛使用基于 RNA 的治疗药物，需要从实验室转向大规模生产。微流体技术可将生产规模从适合临床前研究的批量扩大到临床和商业生产，并且使用相同的工艺，只需很少的再开发工作。

如上所述，一台 NanoAssemblr™ 经典混合器以 20 mL/min 的速度运行时，4 小时一班可生产 28 000 剂疫苗。对于更大的批量，制造商可以通过并行使用多个相同的微流体混合器来扩大生产规模。此外，NxGen™ 技术可以轻松实现扩大规模，即可扩大混合器的尺寸，使通过单个混合器的流速提高一个数量级，同时保留混合的基本物理特性，并促进控制良好、可重现的条件。因此，NxGen™ 技术可以使用相同的技术将纳米颗粒的生产规模从临床前扩大到工业规模，从而最大限度地减少工艺再开发并降低风险。

NxGen™ 技术提供独立于规模的生产，因为系统可通过纵向扩大规模而不是横向扩大规模从实验室小规模运行到连续生产。在 Roces 等人进行的一项研究[4] 中，选择了 GenVoy-ILM™ 脂质混合组合物，其中含有一种类似于 MC3 的可电离脂质，其表观 pKa 值为 6.0。然后使用 NanoAssemblr™ 经典混合器和 NxGen™ 技术在 12（经典系统和 NxGen™ 技术）、60（仅 NxGen™ 技术）和 200 mL/min TFR（NxGen™ 技术和 GMP 系统）下生成空白和载有聚腺苷酸 (PolyA) 的 GenVoy-ILM™ 可电离 LNP。空白制剂的大小 (55 nm) 明显小于负载 PolyA 的制剂 (78 nm) (p < 0.05)。在所有测试速度下，两种 LNP 的大小均相当。此外，纳米颗粒的大小相当，且具有较高的 polyA 包封效率（大于 95%）[4]。

新型 NxGen™ 微流体混合器设计可实现从实验室规模 (12 mL/min) 到超过 20 L/h 的 GMP 生产要求的无缝扩大生产 [5]。此外，通过切向流过滤，可以实现可放大性下游处理，以支持高产量纳米药物的微流体生产。最后，该研究证实了使用不依赖于规模的制造工艺快速、可重现地制造纳米颗粒的可能性，从而降低了从实验室生产转向获批商业产品生产的风险。

具有高通量和高流速容量的微流体平台，例如 NanoAssemblr™ 系统 [4]，已在市场上销售。NanoAssemblr™ 制造平台可将用于 mRNA 药物的核酸和脂质制剂掺入小到足以放在实验室工作台上设备的一端。

利用 NanoAssemblr™ 平台制成的 LNP 结构均匀一致。此外，由于 NxGen™ 技术采用相同的混合器设计，从实验室生产转化为商业批量生产，因此可以轻松提高 LNP 的产量，从而为候选药物的研发节省数月时间，进而节约成本。这种工作流程大大简化了 mRNA-LNP 的开发，使对疾病有深入了解的研究人员能够探索基因组药物的临床潜力。

* 22 000 名受试者 x 2 剂 x 30 ug 剂量 = 1.32 g

‡任何其他第三方商标均为其各自所有者的财产。

参考文献

1. Bahl K, Senn JJ, Yuzhakov O, et al. Preclinical and Clinical Demonstration of Immunogenicity by mRNA Vaccines against H10N8 and H7N9 Influenza Viruses. Molecular Therapy. Volume 25, Issue 6,2017, Pages 1316-1327, ISSN 1525-0016, https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.03.035.
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12. Kastner E, Kaur R, Lowry D, et al. High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization. Int. J. Pharm. 2014, 477, 361-368.