纳米药物为细胞和基因治疗等治疗方案提供了一条前景广阔的新途径，可用于治疗自身免疫性疾病、癌症、罕见遗传性疾病等。一些有待探索的新应用包括早期疾病检测，或为患有复杂疾病且现有疗法无效的患者提供分子定制化治疗。
目前，基因编辑、基因治疗和 mRNA 这三个药物领域的发展尤为迅速，一系列新技术平台为新型诊断和治疗解决方案提供了支持。脂质纳米颗粒 (LNP) 等非病毒基因递送方法有可能通过优化的 LNP 工艺递送一系列基于 RNA 的治疗药物和疫苗，从而产生精确的制剂。
脂质纳米颗粒有助于使纳米药物成为现实
寻找有效的递送方法仍然是开发细胞和基因治疗的关键挑战。基于 DNA、RNA 和其他核酸的制剂在到达靶细胞的过程中面临着一些障碍。即使治疗药物到达了靶细胞，也会在细胞的生物液体中迅速降解，无法积聚或渗透，从而产生疗效。因此，创新、有效的递送系统对于靶向、安全、高效的细胞内核酸递送必不可少。
LNP 是一种非病毒递送系统，可携带大量有效载荷，具有设计灵活、易于制造和多剂量能力等特点。它们可以用经过修饰的脂质赋形剂制成，以便将各种基于核酸的活性药物成分 (API) 递送到体内的不同靶点。
每种脂质纳米颗粒都由以下四个部分组成
- 可电离脂质与核酸结合，在生理 pH 值下保持中性电荷，以最大限度地降低毒性并允许电荷随 pH 值变化而转移，从而限制细胞毒性效应。
- 辅助脂质有助于 LNP 稳定性、细胞内摄取和内体逃逸。
- 胆固醇与载脂蛋白 E (ApoE) 结合并通过低密度脂蛋白 (LDL) 受体介导内吞作用。
- 亲水性聚乙二醇化脂质形成水屏障，防止 LNP 在组装过程中聚集，并延长血液循环寿命。
即使对这四种成分的化学结构和比例稍作改变，也能改变 LNP 的特性和递送效率。这种适应性使选择性器官靶向作用 (SORT) 成为可能，即治疗开发人员可通过修改颗粒设计来克服肝外 mRNA 递送和基因编辑系统带来的挑战。
一项研究发现，在向肝脏递送 mRNA 的传统四组分 LNP 中添加第五组分（称为 SORT 分子），可使不同 cargo（核酸和蛋白质）在治疗相关的细胞类型（例如上皮细胞、内皮细胞、B 细胞、T 细胞和肝细胞）中实现基因表达和基于 CRISPR/Cas 的基因编辑 (1)。调整纳米颗粒的分子组成有助于其与血清中的特定蛋白质结合，从而向靶点递送，并促进 mRNA 向靶器官的生物分布。这些特性使我们有可能设计出一系列用于肝外递送的纳米材料；
可电离脂质是 LNP 的主要成分，可实现高效的细胞递送并克服有效载荷的限制。在另一项研究中，一研究小组使用来自新型可电离氨基脂质库的可电离阳离子脂质来共同封装更大的 Cas9 mRNA 和单导向 RNA (sgRNA) (2)。数据显示，在两种侵袭性癌症模型中，单次或两次给予靶向作用于 PLK1 基因的 CRISPR-LNP (cLNP) 制剂可抑制肿瘤生长并提高存活率，PLK1 基因是有丝分裂所需的激酶，可避免分裂细胞的细胞周期停滞和细胞死亡。
这些发现证明，采用定制可电离阳离子脂质的靶向脂质纳米颗粒有可能用于靶向基因编辑和新型治疗药物的递送。因此，测试和改变 LNP 中的脂质为更广泛地转化 RNA 治疗药物和疫苗提供了大量的机会。
对脂质进行分类，找到 LNP 的最佳选择
可电离脂质是脂质纳米颗粒的重要组成部分，在保护核酸和促进核酸的细胞运输方面发挥着重要作用。它们具有独特的 pH 值敏感性，可随着 pH 值的变化而转移电荷。在酸性 pH 值下，它们带正电荷，将核酸缩合成 LNP，但在生理 pH 值下，它们呈中性，将毒性降至最低。尽管美国 FDA 已批准将可电离脂质用于 RNA 递送，但将其用于临床应用仍需克服一些挑战。
用于 RNA 递送的可电离脂质通常有五种类型：
- 不饱和可电离脂质：
- 增强膜破坏和有效载荷释放
- 并不总是与有效的体内 RNA 递送相对应，因此需要进行合理的设计和筛选
- 多尾可电离脂质：
- 具有更强的内涵体破坏能力
- 通常具有稳定的骨架和较低的降解性，因此毒性和免疫原性会造成限制
- 可电离聚合物脂质：
- 通过疏水聚集支持颗粒形成
- 可重新优化以实现有效的基因沉寂
- 即使经过纯化，仍包含不同取代化合物的混合物，这增加了其复杂性
- 有毒的多阳离子核心和不可降解的骨架为临床转化带来了额外的障碍
- 可生物降解的可电离脂质：
- 在生理 pH 值下稳定，但可在组织和细胞内发生酶水解。
- 酯基的位置和立体效应可显著影响可电离脂质的清除率和效力
- 合成困难和过早释放的风险可能会限制其应用
- 支尾可电离脂质：
- 增强内涵体逃逸能力，具有整合不同治疗模式（如基因沉默、表达和编辑）的潜力
- 尾部分支增多需要深入研究
能将纳米颗粒递送到培养细胞的可电离脂质并不一定能成功转化为能成功进行动物实验。临床可电离脂质的合成需要多个步骤，这给可放大性带来了挑战。此外，劳动密集型合成工艺使得制备合理设计的可电离脂质候选物变得困难。
除了关注安全性和效力之外，药物开发人员还面临着优化可电离脂质结构特性和其他功能（如靶向性和免疫调节）的挑战。数十年来对脂质纳米颗粒的研究表明，有必要对可电离脂质进行分析和表征，以确保疫苗和其他基于 mRNA 的治疗药物的产品质量。为解决这一问题，可以访问专有脂质库，该库根据这些脂质的结构对其进行系统分类，以开发定制制剂。
优化和分析脂质制剂
根据 UBC Michael Smith 实验室和生物医学工程学院助理教授 Anna Blakney 博士的说法，继 mRNA COVID-19 疫苗和基于 LNP 的药物 Patisiran 之后，LNP 在 RNA 递送方面处于领先地位，对其进行优化对于成功至关重要。她强调了使用 LNP 时面临的两大挑战：制剂和组装过程，并认为最复杂的工作是找到合适的 LNP 制剂，这既是一门艺术，也是一门科学。
可电离脂质为纳米药物提供了一条令人兴奋的发展道路，因此必须根据其理化属性（包括尺寸、尺寸分布和封装效率）、细胞摄取和体外药效，重点测试和优化有前景的制剂。改变溶剂组合，同时完成封装或粒度等物理参数的分析测试以及成分、特性和纯度的测定，是制剂设计过程中的关键步骤。
在一项名为”优化诱导多能干细胞 (iPSC) 质粒表达的 LNP 制剂”的案例研究中，研究人员发现，尽管制剂的物理特性相似，但其体外性能却有很大差异 (3)。使用 NanoAssemblr™ Spark™ 系统快速生产含有微克量 mRNA 的微升制剂，以系统地筛选组合物的特性和活性。
按照不同的胺磷 (N/P) 比，制作了一组含有 PNI-Ila（一种专有的可电离阳离子脂质）和不同辅助脂质的制剂。这种带正电荷的聚合物胺基团与带负电荷的核酸磷酸基团之比可影响聚合物型基因递送载体的许多特性，例如净表面电荷、尺寸和稳定性。N/P 比对于向人类 iPSC 衍生皮质神经元递送质粒的制剂有效性至关重要。
为确定在这一治疗相关细胞类型中具有最佳性能的候选制剂而进行的分析测试显示，N/P 比更高的制剂封装效率更好。然而，在体外，测量到神经突长度减少，显示对细胞健康产生负面影响。这项研究表明，进行经验测试对于确定理想制剂至关重要。
探索纳米药物的可能性
进一步的优化，包括对 LNP 进行功能化，以开发用于靶组织的药物，有可能提高制剂效率并避免发生脱靶效应。尽管优化 LNP 制剂非常复杂，但 Cytiva 可提供各种 cGMP 生产的脂质，使研究人员和开发人员能够根据自己的独特需求定制药物递送系统。Genvoy-ILM™ 递送平台包括现成的研究专用试剂，例如 GenVoy-ILM™ 脂质混合物，以及可用于在通往临床的道路上定制制剂的专有脂质库。
我们的生物制药服务部门技术团队可以帮助您为病毒和非病毒纳米药物开发合适的分析检测方法，包括：
- 药品同一性确认
- 物理表征
- 验收检测
- 稳定性研究
- GMP 放行测试
- 毒理学测试
- 原材料测试
利用递送平台进行优化可实现药品从临床前开发到临床开发的无缝扩展，从而减少昂贵的原材料需求，进而节省时间和金钱。我们的团队不仅帮助科学家和药物开发人员选择合适的制剂，而且我们还提供采用 NxGen™ 技术的 LNP 生产仪器，可放大性地用于先进的临床前和临床生产。
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REFERENCES
- Dilliard SA, Cheng Q, Siegwart DJ. On the mechanism of tissue-specific mRNA delivery by selective organ targeting nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Dec 28;118(52):e2109256118. doi: 10.1073/pnas.2109256118. PMID: 34933999; PMCID: PMC8719871.
- Rosenblum D, Gutkin A, Kedmi R, et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Sci Adv. 2020 Nov 18;6(47):eabc9450. doi: 10.1126/sciadv.abc9450. PMID: 33208369; PMCID: PMC7673804.
- Brown A, Cayabyab C, De Souza RAG, et al. Low Volume Production Of Nanoparticles That Are Effective Transfection Systems. In iPSC-derived Cells, Immune Cells and Other Primary Cell Cultures. Poster. Precision NanoSystems (now Cytiva). Accessed February 2024: https://www.precisionnanosystems.com/docs/default-source/pni-files/posters/2018_spark_mrna_ipsc_l_final_e.pdf?sfvrsn=bb1fd2fd_0
- Han X, Zhang H, Butowska, K. et al. An ionizable lipid toolbox for RNA delivery. Nat Commun. 12, 7233 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-27493-0
- Blakney AK, McKay PF, Hu K, et al. Polymeric and lipid nanoparticles for delivery of self-amplifying RNA vaccines. J Control Release. 2021 Oct 10;338:201-210. doi: 10.1016/j.jconrel.2021.08.029. Epub 2021 Aug 18. PMID: 34418521; PMCID: PMC8412240.
- Lou G, Anderluzzi G, Schmidt ST, et al. Delivery of self-amplifying mRNA vaccines by cationic lipid nanoparticles: The impact of cationic lipid selection. J Control Release. 2020 Sep 10;325:370-379. doi: 10.1016/j.jconrel.2020.06.027. Epub 2020 Jul 1. PMID: 32619745.