Western blotting（也称为免疫印迹）是一种成熟且广泛用于蛋白检测和分析的技术。该方法基于通过抗体与固定在膜上的蛋白质特异性结合来构建抗体：蛋白质复合物，然后用多种检测方法之一检测结合的抗体。
尽管 Western 印迹方案的细节可能因应用而异，并根据特定蛋白质的特性和所需信息的水平进行调整，但它们都遵循一些共同的基本步骤。在本指南中，我们将探讨 Western 印迹的这七个步骤。
您知道吗：Western 印迹于 1979 年首次提出，现已成为生命科学研究中最常用的方法之一。
步骤 1. 样品制备：
在电泳分离之前，通常先对相关样品进行一定程度的初步处理。生物基质较复杂。目的蛋白可能是样品中数千种蛋白质中的一种，此外还有核酸、多糖和脂质，所有这些都可能干扰分析。
有许多方法可用于破坏细胞并制备细胞内容物，以便进行 Western 印迹分析。使用尽可能温和的提取程序。尽可能在冰上快速提取蛋白质，并在有适当缓冲液的情况下保持 pH 值、离子强度和稳定性，以防止蛋白质降解。在 1-D 凝胶电泳前，通常无需对样品进行处理。但是，样品净化可以去除核酸、多糖和盐等潜在干扰化合物，从而提高电泳性能。我们的 SDS-PAGE 净化试剂盒专为制备因含有盐分或蛋白质浓度较低而难以分析的样品而设计。
步骤 2. 凝胶电泳：
电泳是第二步，是根据大小、形状和/或电荷分离蛋白质的常用方法。电泳是一种基于电场中带电分子流动性的分离技术。主要用于分析和纯化蛋白质或核酸等大分子。因此，在考虑让您能够最有效地从特定分析中获取所需最多信息的条件时，这将有助于选择过程。
电泳通常是将含有相关分子的样品装入多孔基质（聚丙烯酰胺）的孔中，然后施加电压。样品中不同大小、形状和带电的分子以不同的速度穿过基质。分离结束时，分子被检测为基质中不同位置的条带。
选择凝胶时，须使用能够最佳分离样品中蛋白质的丙烯酰胺浓度。高分子量蛋白质在丙烯酰胺含量较低的凝胶中分离效果最佳，而较小的蛋白质最好在丙烯酰胺含量较高的凝胶中进行分离。图片显示了每种丙烯酰胺浓度下九种不同蛋白质的分离模式。分子量标记（如 Amersham ECL™ 彩虹标记）可用于确定凝胶中运行的蛋白质大小。
步骤 3. 转印：
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 完成蛋白质分离后，下一步是将凝胶中的蛋白质转移到固体支撑膜上，支撑膜通常由硝酸纤维素或 PVDF 等化学惰性物质制成。通过印迹法，可以使用特异性抗体检测膜上的蛋白质。当凝胶运行电流停止时，从凝胶中转移出来的蛋白质被固定在各自的相对迁移位置上。Amersham Protran™ NC 和 Hybond™ PVDF 膜均具有高蛋白质结合能力，是 Western 印迹法的理想选择。
单击此处了解有关 Western 印迹转移不同方法的更多信息。
步骤 4. 抗体探针孵育：
蛋白质样品被分离并转移到膜上后，使用特异性抗体对目标蛋白质进行检测和定位。通常情况下，Western 印迹方案使用针对目的蛋白的未标记一抗和针对一抗恒定区的物种特异性已标记二抗。二抗不仅作为标记的载体，也是放大发射信号的机制，因为理论上许多二抗可以同时与一抗结合。这是最大限度提高检测潜在灵敏度的最有效方法之一。
因此，二抗通常是多克隆抗体，可以靶向作用于一抗框架区域上的表位；特异性仅限于物种和免疫球蛋白同种型。然后测量标记的二抗发出的信号，该信号与膜上目标蛋白质的数量成正比。用 BSA 或 Amersham ECL™ 阻断试剂进行阻断是抗体探针检测前重要的第一步，可避免抗体与膜非特异性结合。二抗通常与 CyDye™ 结合用于荧光检测，或与 Amersham ECL™ HRP 偶联抗体等辣根过氧化物酶结合用于基于化学发光的检测。
步骤 5. 检测：
放射性同位素试剂和显色试剂已被广泛使用多年，但由于处理放射性同位素的安全性问题和显色试剂的灵敏度较差，其受欢迎程度有所下降。目前，化学发光和荧光是 Western 印迹中最常用的两种检测方法。放射性同位素试剂和显色试剂已被广泛使用多年，但由于处理放射性同位素的安全性问题和显色试剂的灵敏度较差，其受欢迎程度有所下降。酶检测方法（例如化学发光法）需要添加一种试剂，当试剂与结合二抗的酶 (HRP) 发生反应时会发光。为了获得更高的检测灵敏度、更强的光强度和更持久的信号，人们在开发基于 HRP 的检测试剂（例如 Amersham ECL™ Prime 和 ECL Select™）方面付出了巨大的努力。
另一方面，基于荧光的检测在结合已标记二抗后不需要额外的试剂。基于荧光的检测系统使用直接与抗体或链霉亲和素结合的荧光实体或荧光团。荧光团可以使用特定波长的光源激发，从而发光。
无需添加检测试剂，而是通过配备合适光源和发射滤光片的设备（例如激光扫描仪）直接检测荧光信号。Amersham ECL Plex™ 采用基于 Cy3 和 Cy5的检测方法，而 Amersham CyDye™ 700 和 800 采用近年来越来越流行的基于 NIR 的检测方法。基于荧光的检测还能实现多路复用，即可在同一印迹上检测到多个蛋白质目标。基于荧光的检测还可以更容易地使用 Amersham™ Quickstain 进行总蛋白归一化。
步骤 6. 成像：
Western 印迹工作流程中数据分析前的最后一步是图像采集。增强化学发光 (ECL™) 基于添加的鲁米诺底物与辣根过氧化物酶 (HRP) 标记抗体之间的反应。存在 HRP 的情况下，过氧化氢催化鲁米诺氧化，这一反应导致发光。然后化学发光信号可通过 X 射线胶片或通过使用基于电荷耦合器件 (CCD) 相机的成像仪（例如 Amersham ImageQuant™ 800）进行数字成像来检测。
使用荧光检测时，荧光团与一抗或二抗结合。荧光团通过特定波长的光激发后发光。这可以通过基于 CCD 的成像仪（如 Amersham ImageQuant™ 800）或高灵敏度激光扫描仪（如 Amersham Typhoon™）检测到。
分析：
使用 Amersham ImageQuant™ 800 CCD 成像仪或 Typhoon™ 激光扫描仪检测信号后，膜图像上会出现一条或多条可见的蛋白质条带。通过与标记蛋白的比较可以估算出蛋白质的分子量，并且由于蛋白质的量与条带强度相关（在检测系统的范围内），因此可以确定蛋白质的量。
在大多数应用中，只需确认存在蛋白质并粗略估计其数量即可。但在其他应用中，需要进行定量分析，以确定蛋白质的相对或绝对水平。为此，ImageQuant™ TL 软件提供了准确量化印迹上蛋白质所需的全套分析工具。IQTL 软件也可用于受监管环境 (IQTL SecurITy)，以实现数据的可追溯性。
