Western 印迹中的蛋白质定量
Western 印迹数据通常为半定量数据，分析通常提供相对丰度而非绝对浓度。定量测量依赖于一种在有效范围内信号强度与蛋白质浓度之间存在已知关系的检测方法。
合适的检测方法是一种支持密度测定的方法（定量方法），并提供足够的准确度以满足实验目标。
什么是密度测定？
密度测定法可确定溶液中、凝胶中或转移到膜后阶段的样品光密度。该技术使用独立密度计、成像系统或单独的软件。
在 Western 印迹中，密度测定法可在所选检测方法的线性动态范围内对蛋白质进行定量。检测方法包括比色法和免疫印迹法（通过化学发光、荧光和放射性标记）。
软件算法可确定选定区域的信号密度。该区域可能是特定的蛋白质条带。该软件可以将测得的密度与背景区域（通常与目标条带相邻）进行比较，从而得出相对测量值。
哪些因素影响密度测定的可靠性？
定量的重要性根据具体 Western 印迹实验而有所不同。适当的检测方法可提供实验所需的定量水平。在选择检测方法时，应考虑以下因素：
- 灵敏度：影响低丰度蛋白质的检测下限。
- 线性动态范围：与蛋白质浓度相当的信号强度范围。
- 信号稳定性：长期检测信号的能力。
- 信噪比 (SNR)：任何非特定背景上的信号清晰度。
高灵敏度可提供检测低丰度蛋白质的能力，并影响线性动态范围。从高信号强度到低信号强度的线性动态范围可支持在同样广泛的蛋白质浓度范围内进行精确定量（图 1）。
图 1. 测量基于 CCD 相机的成像仪的线性动态范围。
使用 Amersham ECL Plex 进行荧光检测可提供宽广的线性动态范围，从而可以检测和比较同一印迹上的强弱条带（图 2）。
图2. Amersham ECL Prime 信号持续时间监测了 3 h。大部分条带仍可检测到，即使在 3 h 后仍可精确定量。
抗体特异性、膜材料、封闭剂和检测/成像系统会影响从背景中识别信号的能力。准确的定量依赖于足够的 SNR。
不同的检测方法有什么不同？
基于比色法的方法非常适合定性分析（确定蛋白质存在与否），尤其是纯化样品分析。但是，这些方法的线性动态范围往往较窄，限制了其定量能力。
常见的比色法包括 Lowry 和 Bradford 颜色变化测定法，以及 Coomassie™ Blue 和 Ponceau S 总蛋白染色。除了蛋白质的存在与否外，这些方法的密度测定还提供了一些半定量数据，以分别调整或解释载量。
与比色法相比，免疫印迹法支持更宽的线性动态范围，尽管它们在其他关键领域有所不同。Western 印迹扫描仪拥有先进的成像系统和软件，利用线性范围，提供比比色法更准确的定量。
请参阅第 2 部分以了解关于免疫印迹检测方法的更多信息。如需成像和定量方面的支持，请下载我们的成像和 Western 印迹原理与方法手册。