蛋白质定量 - 第 2 部分
在有关 Western 印迹（免疫印迹）蛋白质定量的系列文章中，第 1 部分讨论密度测定及其影响因素。该文章的第 2 部分讨论了适合定量分析的常见化学发光、荧光和放射性标记检测方法。
使用化学发光检测进行定量
增强化学发光 (ECL) 依赖于辣根过氧化物酶 (HRP) 偶联的二抗与含有底物和鲁米诺的 ECL 试剂发生反应。
该反应释放出可测量的光（可通过 X 射线胶片或数字成像仪检测），其与宽广线性动态范围内的蛋白质浓度成正比。
一般来说，X 射线胶片不如数字成像仪适合定量。胶片是膜和定量之间的媒介，限制了线性动态范围，使强度的细小差异显得更大。当信号饱和时，胶片还可以掩盖样品之间的差异。
相比之下，数字 Western 印迹成像仪使化学发光分析变得简单直接。成像系统捕获信号，软件使用密度测定法进行定量。该方法可以有效测量各泳道蛋白质条带之间的相对信号。
图 1 展示了基于数字电荷耦合器件 (CCD) 相机成像和 X 射线胶片之间的线性动态范围差异。
图 1. CCD 相机与 X 射线胶片在化学发光条带检测方面的比较。所有条带都在 CCD 相机的线性动态范围内 (A)。强度最大的条带会导致胶片饱和 (B)。
化学发光也有局限性。其无法实现真正的多路复用，这意味着将信号归一化为参考蛋白可能不准确。通常，靶向作用于参考蛋白的唯一选择是：
- 用另一种针对参考蛋白的一抗剥离并重新探测膜。
- 分别对目的蛋白和参考蛋白运行重复的凝胶电泳和膜转移。
- 使用在相同宿主中培养、针对目的蛋白和参考蛋白的两种一抗。
这些选项在实践中可能具有挑战性，会影响可重复性并增加方案的时间。第三种选项也要求目的蛋白和参照物之间具有足够的分辨率，以便同时成像。
使用荧光检测进行定量
通过荧光进行的 Western 印迹检测使用荧光团偶联的二抗，避免了需要酶促反应。基于激光扫描仪或 CCD 相机的系统可激发荧光团并收集发射的光以生成图像。
荧光检测灵敏、稳定、可重现。该方法动态范围宽，可在不同实验中进行精确定量比较（图 2A）。
荧光还支持多路复用，可同时对多种荧光团成像，包括分子量相似的荧光团（图 2B）。多路复用简化了对参照物的归一化，无需额外步骤，也不会因剥离造成目的蛋白的潜在损失。
图 2. 用 Cy3 标记的二抗荧光检测转铁蛋白的系列稀释液，展示了 Amersham ECL Plex 的宽动态范围 (A)。使用 Amersham ECL Plex 对两种形式的人 Akt 蛋白（磷酸化蛋白和总蛋白）进行多路复用检测 (B)。
2-D 荧光差异凝胶电泳 (2-D DIGE) 是使用荧光多路复用进行归一化技术的一个示例。凝胶上的每个点都有一个内标物，可最大限度地减少凝胶之间的差异，从而对多个凝胶上的样品进行比较和密度测定。
放射性标记应用中的定量
尽管在处理放射性标记膜时有安全性方面的考虑，但放射性同位素在其可预测的半衰期内可提供灵敏而稳定的信号。
传统上，用于免疫印迹的放射性标记抗体需要 X 射线胶片来检测。尽管该方法仍然很常用，但在线性动态范围方面存在与化学发光相同的缺点。
数字成像系统（例如 Typhoon 生物分子成像仪）提供磷光成像作为多种成像模式之一。这种模式以荧光屏为媒介，提供了一种检测放射性的替代方法。
与胶片不同的是，荧光屏可在较宽的线性动态范围内对蛋白质进行灵敏的检测和定量。成像系统对光刺激发光进行解读，将其转换为定量数据。
这些成像系统内置了分析软件，可以指导用户进行成像和密度测定分析。
如何选择最合适的检测方法？
不同项目的实验目标和定量要求不同。用户可以将单个实验或项目需求与每种检测方法的优势和局限性进行比较，从中获益。
首选方法将为实验提供足够的灵敏度和线性动态范围。在多次实验中，信号稳定性有助于对不同时间进行的印迹进行比较。
对于所有免疫印迹方法，抗体的选择都会影响非特异性背景的水平。然而，数字成像系统允许用户管理这种信噪比，并简化从成像到分析的过程。
如需获得更多提示和技巧，请下载成像和 Western 印迹原理和方法手册。