用于蛋白质表达结果分析的总蛋白染色
如果不考虑适当的加载和归一化对照，Western 印迹法生成的数据可能会产生误导并充满不准确性。如果没有合适的参考点，特定蛋白质在响应某种特定的处理、操作或刺激时表达的变化可能会被错误地解读。蛋白质丰度的相对定量对于传达所观察变化的意义尤为重要，因为目标蛋白质经常在生理过程中发挥关键作用。要生成准确、可重复的 Western 印迹数据，可靠的蛋白质负载标准化和参照对照归一化是成功不可或缺的要素。
Western 印迹的蛋白质归一化成分可作为内部对照，需要研究者设定一个基线来进行相对比较。通过这种方式，蛋白质表达变化能在不同条件下得到一致的量化，从而确保数据的连续性和可重复性。观察到的蛋白质表达变化（响应 x）有多少是由于目的蛋白丰度的实际差异造成？为了回答这一问题，通常采用管家蛋白作为参考点。这些蛋白质在所有细胞中具有一致的高水平表达特征，并且由于其维护或管家职责，通常不受实验条件的影响。1肌动蛋白、微管蛋白和 3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 等管家蛋白是用于泳道间归一化常规使用的载荷对照物实例。这是因为它们通常与研究人员感兴趣的蛋白质稳定地共同表达。
但是，它们的使用也存在一些缺点，包括在不同实验条件下的表达可能不成比例、由于在所有样品中都大量存在而导致膜饱和、以及依赖单一数据点进行归一化。2-4为了解决这些缺点，出现了更适合、更灵敏的新型蛋白质归一化方法。用于数据归一化的总蛋白染色法就是这样一种方法，它作为一种有效的替代方法被迅速采用。
总蛋白归一化是基于凝胶或膜的一个泳道中几个或所有条带密度的总和，作为总转移蛋白的测量值。与管家蛋白归一化方法不同的是，总蛋白染色是一个独立于抗体的单步可视化过程，避免了实验操作的可能性，最大程度地减少了人为误差。
除了克服使用管家蛋白作为负载对照的局限性外，总蛋白染色还考虑到了总蛋白转移效率。在 Western 印迹过程中，可在不同阶段使用适当的凝胶或膜染色剂观察总蛋白，从而作为连续的程序控制。2该技术通常涉及基于染色剂的检测（例如，Ponceau、Coomassie、银、胶体金），之后立即对膜或凝胶成像进行定量研究。另外，最近还出现了一种无染色技术，该技术采用了一种专有的聚丙烯酰胺凝胶嵌入式紫外光依赖性化合物。这种方法的优点是，共价结合和嵌入的荧光团允许在 Western 印迹过程中的任何时候对蛋白质进行曝光和成像。
为了获得条带密度测量结果，首先必须捕获膜的图像，为此最好使用数字成像平台。然后记录测量结果并使用兼容软件进一步分析。之后，将每条泳道所有条带的总和与目的蛋白的条带密度值进行归一化，该目的蛋白的条带密度值在接下来的步骤中使用特定的检测一抗和二抗获得。2通常使用多个公式和电子表格来进行求和、变化和统计计算。定量分析正迅速成为提交给知名、同行评审的科学期刊的常态，但研究人员对于从原始数据到分析后可发表结果的路径往往感到矛盾。为了化解这些矛盾，可使用与 qPCR 数据分析类似的方法进行相对蛋白质归一化计算，其中将每个生物/技术重复的倍数变化确定为归一化加载对照密度的一部分。2使用生物/技术重复确定倍数变化的基础允许计算平均值和进行相关统计分析（p 值），从而进一步加强数据。
与蛋白质丰度密度测定的分析一致性是获得可靠 Western 印迹数据的关键。可重复性取决于是否使用了适当、准确的基线参照对不断变化的目的蛋白表达水平进行相对归一化。鉴于管家蛋白固有的弱点，总蛋白染色提供了一种替代检测和归一化方法，可对蛋白表达水平进行更精确的定量。当然，获得一致 Western 印迹数据的难易程度也受到样品制备的熟练程度、整体技术以及对可用软件和分析平台了解的影响。
参考文献
1. McDonough AA et al., “Considerations when quantitating protein abundance by immunoblot,” Am J Cell Physiol 308:C426-C433, 2015.
2. Posch A, Taylor CS, “The design of a quantitative western blot experiment,” Biomed Res Intl 2014:361590, 2014.
3. Greer S et al., “Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells,” J Immunol Methods 355:76-79, 2010.
4. Ferguson ER et al., “Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies,” Proteomics 5:566-571, 2005.