抗体纯化工艺通常采用平台方法进行开发。利用实验设计 (DoE) 程序或高通量筛选，只需调整几个工艺参数即可确定单个单元设备的最佳运行条件。但是，如果通过实验设计 (DoE) 无法确定稳健的工艺条件该怎么办？
病毒样颗粒 (VLP) 是一种充满前景的分子形式，可用于开发靶向对抗新型病毒和癌症的疫苗。VLP 的大小和形状使其易于被抗原呈递细胞 (APC) 摄取，从而能有效地诱导适应性免疫反应。
简介
如果采用平台方法，只需调整几个层析纯化步骤的参数即可进行新分子纯化。然后可以根据实验设计 (DoE) 利用高分辨率筛选实验来探索其余的设计空间。虽然这种方式对于大部分平台分子都有效，但需要的样本量大，需要进行大量的离线分析，并且仅限于校正的实验范围。
本案例研究对采用两步洗脱的精纯步骤的工业化分离问题进行了分析。所面临的挑战是从包含重要聚集体和片段的混合物中分离出抗体，同时保留吸附剂材料并保持高收率与高纯度。结合平台工艺与实验设计 (DoE) 的工艺开发方法无法确定收率大于 65% 的任何适用工艺。相比之下，机理模型可以根据流体动力学和热力学原理通过数字模拟来描述样品组分的传输。
材料和方法
本案例研究采用高结合载量阳离子交换填料。目标成分为中间洗脱的抗体。需要去除一种低分子量 (LMW) 物质和两种高分子量 (HMW) 物质。使用 GoSilico™ 层析建模软件进行所有模拟、参数估计和工艺优化。虽然从层析图谱中几乎看不到杂质（图 1），但凝胶过滤层析 (SEC) 组分分析（图 2）显示，LMW 杂质与目标抗体严重重叠，去除 LMW 会导致收率低于 70%。
图 1.15 柱体积 (CV) 梯度下的阳离子交换层析 (CEX) 洗脱曲线。
图 2.SEC 组分分析发现洗脱液中有片段和聚集体。
模型校准
通过运行两次示踪法（连接和不连接层析柱）和三次非线性模式梯度洗脱进行模型校准。其他信息通过离线 SEC 组分分析获得。GoSilico™ 层析建模软件利用 SEC 测定的相对组分含量自动生成的假层析图谱，如图 3 和图 4 中的虚线所示。所有未知的模型参数通过曲线拟合测定。曲线图显示总体结果以及杂质放大图。
图 3.模拟单组分曲线（实线）和组分数据（虚线）。
图 4.来自图 3 的放大模拟杂质曲线（实线）和组分数据（虚线）。
基于模型的工艺开发
使用 GoSilico™ 层析建模软件进行模型校准后，后续的工艺开发和优化全部可以在计算机上完成。与实验设计 (DoE) 实验相比，上样量降低了 75%，柱长增加了 50%。结合优化的盐洗脱步骤，可以实现高收率和高纯度。图 5 所示为优化设置。图 6 所示为上样量和柱长保持恒定时的最佳工艺设置。如果只能优化缓冲液盐浓度和步骤/梯度形状，则会同时洗脱出目标抗体和 LMW，因此必要的 LMW 去除步骤会导致产品收率变低。即使后续进行盐梯度洗脱也无法避免同时洗脱 HMW（图 6）。
图 5.优化工艺设置的模拟层析图谱和 KPI 预测。
图 6.部分优化工艺设置的模拟层析图谱和 KPI 预测。
模型质量
虽然通过目测模型拟合非常不错，但只有 95% 置信区间的计算值能提供参数明确与否的相关信息。表 1 所示为各分析和模型参数的 95% 置信区间计算值。对于空间质量作用吸附模型而言，所有电荷和平衡参数的相对置信区间都较低。虽然动力学的值较大，但仍可接受。只有低浓度物质的空间屏蔽参数无法确定，因此设为零。
| 参数 | 目标 | LMW | HMW 1 | HMW 2 |
|---|---|---|---|---|
| 动力学 | 4% | 22% | 9% | 78% |
| 平衡 | 3% | 13% | 4% | 5% |
| 电荷 | 1% | 1% | 0% | 0% |
| 屏蔽 | 1% | 2400% | 174% | 1992% |
提高工艺理解能力
机理建模还可以解释实验设计 (DoE) 无法实现充分屏蔽的原因。LMW 的表面电荷确实低于目标抗体，因此它应该先被洗脱。吸附等温线呈凸形，因此较高的相对蛋白数量无法结合较高的流动相浓度。这导致在洗脱过程中更快的流动浓度出现在目的蛋白高度浓缩之前。事实上，目标峰超过了 LMW，只有降低上样量才能解决该问题。