尺寸排阻层析 (SEC) 通常用于病毒或细胞外囊泡(EV 或外泌体)等大型敏感分子的下游处理。但此 SEC 步骤通常被视为生产瓶颈 — 低流速和有限的样本上样量可能会降低病毒和外泌体纯化的速度。开发 Capto™ Core 填料,旨在解决这一瓶颈并提高大分子的下游处理能力。Core填料是包含具有活化配基的核心层和外层非活性外壳的层析填料(图1)。这种结构实现了双功能作用,在内捕获较小的可通过外壳扩散的杂质,而较大的目标分子可在流穿液中收集1。通过组合尺寸排阻层析和结合层析模式,Capto™ Core 填料可作为 SEC 填料的优先替代选择,用于纯化外泌体或其他大分子。

Capto™ Core 磁珠技术包括具有配基活化核心和外层非活性外壳的层析填料。

图 1. Capto™ Core 填料技术采用了具有活化配基的核心层和非活性的外层外壳的填料。

Core填料功能

惰性外壳加上配基活化核心,再结合组分分离技术,能够提高样本上样量。各微球珠核心通过具有疏水性且带正电荷的配基实现其功能,可对小到足以通过外壳扩散并进入核心的各种杂质进行高效多模式结合。多模式配基确保可在较宽的 pH 值和盐浓度范围内与大多数杂质牢固结合,并限制杂质,使其不会从微球珠中扩散出来1。这是core填料技术的玄妙之处:可使用相对较小的层析柱处理较大体积的样本。本质上,您可以使用这些core填料清除或去除敏感型目标大分子物质中的小杂质,如病毒衣壳、包膜病毒或外泌体。

Core填料外壳的孔径并非单一尺寸。相反,在孔径分布方面,Capto™ Core 700Capto™ Core 400 填料的平均临界值分别对应于 700 kDa 的球状分子和 400 kDa 的球状分子。这些推定临界值数据在 3 分钟停留时间条件下获得1(柱床高度为 20 cm 的层析柱中流速为 400 cm/h 时)。推定临界值受流速影响。流速较低的情况下,较大分子更有可能穿过外壳并与核心中的配基结合。因此,降低流速会降低较大目标分子(如病毒或囊泡)的回收率,但可提高杂质去除率(图2A)。增加流速可提高较大目标分子的回收率,但同时会降低杂质去除率。流速与收率之间的相关性如图 2B 所示。

 

不同病毒 (A) 和不同流速 (B) 下 Capto™ Core 磁珠的目标分子回收率百分比。

图 2. 不同病毒 (A) 和不同流速 (B) 下 Capto™ Core 填料的目标分子回收率百分比。

用于外泌体纯化的Core填料

外泌体不是一系列均质囊泡。它们包括具有不同大小和生物学特性的亚群。就大小而言,外泌体也与其他 EV(即微泡和凋亡小体)有不同程度的重叠2,3。Core填料技术可用于温和纯化不同 EV 亚群。

您可以使用标准中游过滤技术(如死端过滤或深层过滤)去除不需要的大囊泡,并根据需要辅以慢速离心。这种初步澄清可去除尺寸大于您目标 EV 亚群的细胞碎片和囊泡。然后,您可使用core填料技术清除尺寸小于目标 EV 亚群的杂质,无需浓缩补料4-6。经过优化的初步澄清结合core填料流穿层析步骤通常是颇具吸引力且温和的下游工作流程,适用于外泌体纯化。为了在不影响回收率的情况下成功去除较小杂质,务必要选择适当类型的core填料并对core填料流穿层析步骤进行微调。

如果需要,您还可以将core填料技术与结合/洗脱步骤相结合,以从您的目标外泌体亚群中去除类似大小的 EV — 如凋亡小体和微泡6。您可以对此结合/洗脱步骤进行设计,以适应现有的层析系统

 

温和的外泌体生产工作流程,无需结合/洗脱步骤。

图 3. 温和的外泌体生产工作流程,无需结合/洗脱步骤。

案例研究:使用不同 Capto™ Core 填料的回收率和纯度

Ryan McNamara 博士和 Dirk Dittmer 教授(北卡罗来纳大学)评价了 Capto™ Core 400 与 700 填料的回收率和纯度之间的关系。在切向流过滤 (TFF) 和 PEG 沉淀后的外泌体分离工艺中,他们使用预填充 Capto™ Core 700 或 Capto™ Core 400 填料的 1 mL HiTrap™ 层析柱,作为纯化步骤4。在本研究中,纯度测量单位为每微克蛋白的外泌体颗粒数。30–150 nm 的外泌体大于两种填料的临界值。Capto™ Core 400 的临界值为 400 kDa,Capto™ Core 700 的临界值为 700 kDa。假设外泌体将进入流穿液,而蛋白会与 Capto™ Core 填料结合(这可通过流速进行调节,如上所述)。因此,在此工艺中应使用哪种 Capto™ Core填料?

如图 4 所示,使用 Capto™ Core 400 时外泌体回收率较高(Capto™ Core 700 填料的最终外泌体平均浓度为 5.4 ×1010 个颗粒/mL,Capto™ Core 400 填料的最终外泌体平均浓度为6.6 × 10 10个颗粒/mL)。然而,如图 5 所示,使用 Capto™ Core 700 填料时蛋白去除率较高(Capto™ Core 700 填料为 4 × 108 个外泌体颗粒/μg 蛋白,Capto™ Core 400 填料为 1.5 × 108 个外泌体颗粒/μg 蛋白)。电子显微镜检查4,5(图6)显示,使用 Capto™ Core 700 填料纯化后外泌体仍完整无缺。这些结果表明,当纯度是主要考虑因素时,应使用 Capto™ Core 700 填料。Capto™ Core 700 在杂质去除率方面较优,但其潜在缺点是外泌体颗粒回收率欠佳。如图 5 中所示,通过 Capto™ Core 700 外壳的外泌体数量(即外泌体回收率)差异较大,使得使用 Capto™ Core 700 时实验差异更大(与 Capto™ Core 400 相比)。通过 Capto™ Core 400 外壳的外泌体数量(即回收率损失)非常有限。

使用 Capto™ Core 700 磁珠和 Capto™ Core 400 磁珠的颗粒回收率。

图 4. 使用 Capto™ Core 700 填料和 Capto™ Core 400 填料的颗粒回收率。Capto™ Core 400 填料的回收率较高,为 6.6 × 1010 个颗粒/mL,Capto™ Core 700 填料的回收率为 5.4 × 1010 个颗粒/mL。两种填料的流速相同。所有运行实验均在 ÄKTA start™ 层析系统上进行。使用 Particle Metrix ZetaView™ 纳米颗粒跟踪分析仪评定各流穿液中的组分,并使用跨膜四蛋白 CD63、CD9 和 CD81 定量免疫印迹法进行验证。

 

使用 Capto™ Core 400 和 Capto™ Core 700 磁珠进行外泌体纯化后的产品纯度。

图 5. 使用 Capto™ Core 400 和 Capto™ Core 700 填料进行外泌体纯化后的产品纯度。使用 Capto™ Core 700 填料可提高产品纯度,可达到 4 ×108 个颗粒/μg 蛋白,相比之下使用 Capto™ Core 400 填料时产品纯度为 1.5 ×108 个外泌体颗粒/μg 蛋白。采用 BCA 测定法分析蛋白含量。所有运行实验均在 ÄKTA start™ 层析系统上进行。使用 Particle Metrix ZetaView™ 纳米颗粒跟踪分析仪评定各流穿液中的组分,并使用跨膜四蛋白 CD63、CD9 和 CD81 定量免疫印迹法进行验证。

 

使用 Capto™ Core 700 磁珠纯化后流穿液组分的电子显微镜图像。

图 6. 使用 Capto™ Core 700 填料纯化后流穿液组分的电子显微镜图像。纯化后外泌体完整无缺。

总结

病毒或细胞外囊泡等敏感型大分子能够以可扩展的方式纯化,同时兼具良好的杂质去除率和高回收率。借助core填料,可在流穿模式下温和、快速、有效地去除杂质。通过优化运行参数(流穿),可根据需要在不同大小且具有不同杂质特征的大分子(如外泌体)的回收率与杂质去除率之间进行取舍。

鸣谢

我们衷心感谢 Ryan McNamara 博士和 Dirk Dittmer 教授(北卡罗来纳大学)对 Capto™ Core 400 和 700 填料在外泌体上的评定反馈,并允许我们发布相关数据。

了解有关 CAPTO™ 层析填料的更多信息

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  1. Cytiva. Multimodal chromatography Capto Core 400 Capto Core 700 Data File. Capto Core 400 and Capto Core 700 - Multimodal chromatography resins (cytivalifesciences.com)
  2. McNamara, RP, Dittmer, DP Extracellular vesicles in virus infection and pathogenesis. Curr Opin Virol. 2020; 44: 129-138.
  3. Willms E, Johansson HJ, Mäger I, Lee Y, Blomberg KEM, Sadik M, Alaarg A, Smith CIE, Lehtiö J, EL Andaloussi S, Wood MJA, Vader P. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Nat Sci Reports. 2016; 6:22519
  4. McNamara RP, Caro-Vegas CP, Costantini LM, Landis JT, Griffith JD, Damania BA et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2018; 7(1): 1541396.
  5. McNamara RP, Dittmer, DP Modern techniques for the isolation of extracellular vesicles and viruses. J Neuroimmune Pharmacol. 2020; Sep 15(3): 459–472.
  6. Guterstam P, Whitford W.Exosome manufacturing status. Future Medicinal Chemistry. 2019: (10):1225-1236