作者：Takuo Kawase，Chugai 下游工艺开发组高级经理兼科学家，Roche 集团成员
近几年来，抗体治疗管线已经转向更有针对性的患者群体和多样化的抗体模式。这导致对小批量和灵活的模块化生物工艺的需求增加。针对这种变化，行业一直专注于创建灵活的生产解决方案，以最大限度地减少方案的转换时间，并最大限度地提高设施利用率。
我的团队评估了 Fibro 快速层析平台的性能和下游层析工艺的可放大性。
简介
随着生物制药行业朝着更多样化的生物模式管线和目标患者群体的方向发展，对经济高效生产的需求变得更具挑战性。生产设施对一次性灵活解决方案的需求不断增加。在商业生产中，上游操作已经在很大程度上实施了一次性解决方案，但在下游层析中，整体实施仍然滞后。
迄今为止，实施真正的一次性层析的主要障碍之一是成本。填料中流速扩散受限，导致无法在单个批次运行中有效利用填料的。为了实现成本效益，需要在多个批次中重复使用填料。另一方面，尽管现有的替代品（如整体柱和膜）可以提供所需的流速，但目前为止发现结合载量较低。纤维层析，即带有蛋白 A 配基的 Fibro PrismA 具有提供所需流速和高结合载量的优势。这将为快速循环层析提供机会，从而在工艺开发和一次性层析中实现更快的通量，并在单个批次中充分利用单元的使用寿命。
评估 Fibro PrismA 的性能
Fibro 层析使用具有开放结构的纤维素基质。专有结构使该技术能够克服装填柱床层析纯化的扩散和流动限制，以及膜吸附的载量问题（图 1）。由于预计 Fibro 层析可显著提高蛋白 A 层析的载量，我们首先使用不同抗体对它的性能进行评估。
图 1. 不同层析基质的表面积和传质机制。
我们使用五种不同抗体和不超过 60 秒的停留时间评估了 0.4 mL Fibro 原型单元和 4 mL Fibro 原型单元的动态结合载量（DBC）（图 2）。结果显示，两个单元的动态结合载量都很高，在几秒钟的停留时间内高达 45 mg/mL。
图 2. 0.4 mL 和 4 mL Fibro 单元使用五种不同抗体在不超过 60 秒停留时间下的动态结合载量。
层析填料和 Fibro 通量比较
接下来，我们评估了 15.7 mL MabSelect PrismA™ 层析柱和 4 mL Fibro PrismA 原型单元的纯化通量（图 3）。MabSelect™ 填料层析柱的纯化周期为两小时，而 Fibro PrismA 单元由于停留时间短，纯化周期为 6 分钟。这意味着在与 MabSelect PrismA™ 层析柱相同的时间内，Fibro 单元可以纯化超过 2.9 倍的抗体量。或者与填料层析柱相比，Fibro 单元的尺寸可以减少 1/10 以上。
图 3. MabSelect PrismA™ 层析柱与 4 mL Fibro PrismA 原型单元的通量比较。
Fibro 使用寿命研究
然后我们使用 ÄKTA™ Avant 25 系统对 0.4 mL 小规模 Fibro 单元进行了使用寿命研究（图 4）。最初，该抗体 5% 穿透时，Fibro PrismA 的动态结合载为 59 g/L。每 50 次循环至 300 次循环对 Fibro PrismA 单元的动态结合载进行跟踪。每次循环包括 30g/L MV 上样，停留时间为 7.5 秒，以及 60 秒反向流动 1 M NaOH 原位清洁（CIP）步骤。300 次循环后，Fibro PrismA 单元保留了超过 90% 的初始结合载量，没有任何明显的压力增加。
图 4. 300 次循环后 0.4 mL Fibro PrismA 单元的动态结合载量。
下游工艺 Fibro PrismA 放大
最后，我们评估了在 ÄKTA™ avant 150 系统上使用 4 mL 原型单元和在 ÄKTA process™ 系统上使用 160 mL 原型单元放大 Fibro PrismA 的能力。我们以平行方式评估了 75 次循环后的 4 mL 单元和 60 次循环后的 160 mL 单元，以相同的停留时间（工艺性能研究）和两种规模的 MV 数量对该方法进行放大。为了评估两个单元的性能，我们测量了高分子量（HMW）聚集体、宿主细胞蛋白（HCP）、残留 DNA 和LPA（图 5）。两个单元之间没有显著差异，并且循环次数也一致。
我们还评估了整个研究中两个单元的工艺性能（图 6）。4 mL 单元和 160 mL 原型单元的产品收率和背压相似。但是，两个单元之间的池体积不同。造成池体积差异的原因是 4 mL 单元和 160 mL 单元之间的流动分配结构不同以及系统死体积的相对影响。这表明大规模实施需要进一步优化池体积和缓冲液用量，对此我们将在下一步执行。
图 5. 4 mL Fibro Prisma 单元与 160 mL Fibro Prisma 原型单元的纯化性能。
图 6. 研究期间 4 mL Fibro PrismA 单元和 160 mL Fibro PrismA 原型单元的工艺性能。
优化 Fibro PrismA 的工艺条件
为了优化工艺条件，了解填料和 Fibro PrismA 之间的区别非常重要。我们发现，在某些情况下，与填料相同的纯化方案与 Fibro PrismA 一起使用，效果很好。但是，在其他情况下，由于装填填料的层析柱与 Fibro PrismA 之间的系统和单元死体积的差异，需要调整工艺条件。
例如，对于填料，我们通常使用 pH 3.0 的 50 mM 醋酸钠作为蛋白洗脱条件。当我们使用 MabSelect PrismA™ 纯化样品时，洗脱池中的聚集体水平为 2.9%。当 Fibro PrismA 使用相同的纯化方案时，聚集体水平增加到 8.9%。这种增加是由于洗脱池 pH 值较低，池体积较大所致（图 7）。在我们的案例中，我们需要平衡聚集体水平和池体积。
图 7. 案例研究表明，当使用与填料相同的纯化方案时，需要对 Fibro PrismA 单元进行工艺优化。
因此，使用Fibro PrismA 时，我们发现在优化工艺时需要考虑扩散、系统滞留体积、洗涤缓冲液残留和分辨率。优化 Fibro PrismA 条件的优势在于，由于它的纯化时间快，可以轻松快速地优化工艺条件，从而加快工艺开发时间。
大规模生产的一个重要考虑因素是系统滞留体积。与层析柱相比，纯化一定量抗体所需的 Fibro 单元体积相对较小，增加了系统滞留体积的影响。较大的系统体积将带来两点不利影响。首先，每个层析步骤需要使用更多的缓冲液来清除更大的死体积。其次，缓冲液相的混合增加，导致相变变宽，从而导致洗脱峰变宽。此外，由于 Fibro 单元内死体积相对较大，洗脱池体积也会增加。
这将导致洗脱池体积变大，可能会影响产品关键质量属性（CQA），并影响设施匹配度。由于这些原因，为系统选择大小合适的 Fibro 单元，对于确保缓冲液用量和洗脱池体积的最佳性能至关重要。 出于同样的原因，最大限度减少 Fibro 单元连接系统的管路体积也至关重要。由于缓冲液界面之间的混合减少，体积较小的管路将导致缓冲液转换更尖锐。通过优化这些参数，可以减少使用 Fibro 层析进行大规模生产的洗脱池体积。为了验证这一点，我们根据中试规模评估数据模拟了 2000 L 规模的生产操作。
2.4 L Fibro PrismA 和 ÄKTAprocess™ 单元生产模拟
最后，我们使用 2.4 L Fibro PrismA 原型工艺单元和 ÄKTA process™ 系统（表 1）模拟大规模生产场景中的缓冲液消耗量和洗脱池体积。之所以使用 ÄKTA process™ 系统，是因为它是我们生产设施中使用的现有层析系统。我们将模拟结果与 25 L 层析柱中的装填填料进行了比较，结果表明 Fibro 单元的总缓冲液消耗量增加了近 50%，洗脱体积增加了一倍以上（参见表 1 中的池体积）。由于设施与我们整套生产设备的匹配问题，这是在大规模生产中实施 Fibro 的一个潜在问题。为了解决这个问题，我们进行了额外的研究，使用 160 mL Fibro PrismA 原型单元与低流速套件连接到 ÄKTA™ ready 一次性系统。该设置为大规模生产提供了真正的一次性解决方案，并为 160 mL Fibro 单元提供更小、更合适死体积的层析系统。
表 1. 使用 2.4 L 大规模 Fibro 原型单元和 25 L MabSelect™ PrismA 层析柱连接到 ÄKTAprocess™ 10 mm 内径聚丙烯系统的大规模工艺模拟结果。
注：层析柱程序使用系统清洗，而 Fibro 程序则跳过该步骤
在本研究中，我们优化了以下三个参数：
- 洗脱 pH 值
- 洗脱灌注步骤，在洗脱阶段开始时用洗脱缓冲液冲洗系统管线
- 停留时间
在 160 mLFibro PrismA 原型单元和带有低体积流速套件的 ÄKTA™ ready 系统上的工艺优化结果表明，可以减少洗脱池体积，而收率保持一致（图 9）。洗脱缓冲液 pH 值为 3.0，系统灌注，停留时间为 15 秒时，获得本研究的最佳结果。在这些条件下，洗脱池体积可减少 24%，同时将洗脱池 pH 值保持在防止聚集体形成的水平。
图 8. 减少洗脱池体积的同时保持收率一致的优化研究。
与在 ÄKTAprocess™ 10 mm 系统上运行 160 mL Fibro PrismA 单元相比，池体积和缓冲液消耗量分别显著降低 24% 和 40%，说明优化运行条件和匹配正确尺寸的 Fibro 单元与层析系统的重要性。
图 9. 使用更适合特定 Fibro 单元尺寸运行条件和滞留体积的层析系统优化缓冲液消耗量、池体积和循环时间。
根据 ÄKTA™ ready 系统评估结果，对我们的制造套件进行了新性能模拟。可以看到，Fibro 单元的池体积和缓冲液消耗量均可减少（表 2 和 3）。在 500 L 生物反应器模拟中，使用 Fibro 与层析柱的缓冲液消耗量获得了类似的结果，而使用 Fibro 单元的池体积仍然高出 70-85%。在 2000 L 模拟中，使用层析柱的池体积和缓冲液消耗量仍然较小，尤其是对于高滴度情况（5 g/L）。然而，Fibro 单元值在我们工艺可接受的范围内。请注意，高达 2.4 L 的 Fibro PrismA 单元可以在适用于工艺规模的 ÄKTA™ ready 系统上运行，进一步优化洗脱体积和缓冲液体积。由于模拟是针对生产设施中可用的 ÄKTA™ 工艺单元进行的，因此这里未执行此操作。
表 2. 使用 600 mL Fibro 原型单元和 25 L MabSelect™ PrismA 层析柱连接到 ÄKTA process 10 mm 内径聚丙烯系统的 500 L 生物反应器收获物补料的模拟结果。
注：层析柱程序使用系统清洗，而 Fibro 程序则跳过该步骤
表 3. 使用 2.4 L Fibro 原型单元和 25 L MabSelect™ PrismA 层析柱连接到 ÄKTAprocess™ 10 mm 内径聚丙烯系统的 2000 L 生物反应器收获物补料的模拟结果。
注：层析柱程序使用系统清洗，而 Fibro 程序则跳过该步骤
结论
总之，我们从循环寿命研究中发现，0.4 mL 和 4 mL Fibro PrismA 原型单元在长达 300 次循环时具有稳定一致的纯化性能。接下来，我们能够成功地将纯化工艺从 4 mL 放大到 160 mL Fibro PrismA 原型单元，没有任何偏差。从放大评估中可以明显看出，考虑填料和 Fibro 之间的差异，再优化工艺至关重要。特别是，优化运行条件并将正确的层析系统与每个尺寸的 Fibro 单元匹配，对于确保缓冲液用量和洗脱池体积的最佳性能至关重要。我们相信 Fibro PrismA 提供的即用型和超快速纯化功能有助于提高抗体生产工艺的产率，特别是对于临床和小批量生产。