什么是病毒载体？

病毒是只能在活细胞内复制的传染原。分子生物学家利用这种特性将遗传物质递送至细胞中。还对病毒载体用于基因和细胞疗法以及作为预防性和治疗性疫苗的基础进行了探索。在基因疗法中，病毒载体可用于递送功能基因，以替代有缺陷的基因，从而治愈遗传疾病。作为疫苗平台，病毒载体可用于表达和呈递致病性抗原，通过模拟自然感染诱导免疫反应。病毒载体也可用于溶瘤治疗以特异性针对和杀死肿瘤细胞。

病毒载体系统

尽管针对病毒载体的特定应用进行定制，但它们有一些共同的关键属性。应修饰载体以保障安全处理（在宿主中不产生新病毒体）和低毒性（对正常宿主细胞的生理机能无影响）。病毒载体还应该较为稳定（无基因组重排）。对于生产而言，病毒载体应易于量化且适合大规模生产，这一点非常重要。病毒载体系统的示例为逆转录病毒、慢病毒、痘病毒、腺病毒和腺相关病毒。

逆转录病毒

重组逆转录病毒具有稳定整合至宿主基因组中的能力。这些病毒可表达逆转录酶，以将其 RNA 基因组复制到 DNA 中，并可表达整合酶，以将 DNA 拷贝整合至宿主细胞的基因组中。通常，复制缺陷型逆转录病毒用于医学，因为这些病毒可感染和递送其病毒基因组，但不能裂解和杀灭宿主细胞。然而，逆转录病毒只能整合至活跃分裂细胞的基因组中。因此，许多细胞（例如神经元）对逆转录病毒感染和整合具有抗性。

慢病毒

慢病毒是逆转录病毒的一个亚类，但与其他逆转录病毒不同，慢病毒可整合至非分裂细胞的基因组中。作为逆转录病毒载体，慢病毒载体从不包含用于复制的基因。因此，要生产慢病毒，需要在包装细胞系（例如，用编码病毒体蛋白的质粒转染的 HEK293 细胞）中增殖。慢病毒通常用于细胞疗法。

痘病毒

痘病毒科包括许多种属，其中一种就是牛痘苗病毒 (VACV)。由于 VACV 可在人体中诱导强烈的免疫反应，在重组疫苗中将其作为表达异种蛋白的载体进行检测。野生型 VACV 也已成功用于根除天花。VACV 是一种双链 DNA 病毒，通过细胞融合进入宿主细胞。其庞大的基因组 (185 kb) 可耐受超过 25 kb 的外源 DNA 片段的插入，为在具有较大抗原甚至几种抗原的疫苗中使用 VACV 创造了机会。痘病毒也经过修饰和检测，可用于溶瘤细胞疗法。

 

腺病毒

腺病毒是在脊椎动物细胞核中复制的双链 DNA 病毒。与逆转录病毒和慢病毒相反，腺病毒不会整合至宿主细胞的基因组中。腺病毒可轻松地将外源 DNA 引入到自身的 DNA 中，并且可在多种细胞中增殖。此外，已证明腺病毒可诱导广泛的免疫反应，包括细胞毒性 T 细胞反应。因此，在传染病疫苗和溶瘤治疗方面，腺病毒是使用最多的病毒载体之一。它还被用于开发治疗性疫苗和基因疗法。

 

腺相关病毒 (AAV)

AAV 是一种单链 DNA 病毒，可感染人和其他一些灵长类动物的活跃分裂和非分裂细胞。它可以整合至宿主细胞的基因组中，但大多数情况下，作为腺病毒，AAV 复制时不会将其基因组整合至宿主细胞染色体中。腺病毒是一种较大的病毒，可递送高达 36 kb 的 DNA 插入片段，而 AAV 与腺病毒不同，它是一种小病毒，只能递送达 5 kb 的较小插入片段。AAV 主要用于基因疗法。

病毒载体的生产

使用病毒载体解决重要医疗需求的临床研究取得了令人鼓舞的结果，这激起了人们对开发可放大性且经济高效的生产工艺的兴趣。仅就基因疗法而言，估计至 2025 年，全球市场价值将超过 100 亿美元 (2)。若要实现法规遵从性，需要对预期用于治疗用途的产品进行充分表征，并保障产品的高纯度、有效性和安全性，满足高水平的 GMP 合规性。重组病毒载体的持续开发扩大了商业产品管线，促进了病毒载体生产平台的使用。

腺病毒可放大性生产的工艺

为满足市场对病毒载体系统的可放大性和经济高效生产的需求，Cytiva 的科学家开发了一种腺病毒生产工艺，从上游细胞培养至下游纯化，均使用现代工具和技术。这项工艺易于进行规模缩放，并与可蒸汽处理的一次性硬管道工艺设备（图 1）兼容。

上游生产

使用在 HyClone CDM4HEK293 培养基中培养的 HEK293 细胞进行腺病毒生产。为证明上游工艺的稳健性，在波浪式 ReadyToProcess WAVE 25 和搅拌罐式 Xcellerex XDR-10 生物反应器系统中进行了病毒生产。虽然 ReadyToProcess WAVE 25 可能缩短种子细胞培养的用时，因为细胞扩增可在生物反应器中进行，但 XDR-10 作为 XDR 生物反应器平台的一部分提供了可放大性优势。使用波浪式和搅拌罐生物反应器系统获得的结果几乎完全相同，不仅证明了工艺的稳健性（图 2），工艺结果的相似性还表明在生物反应器规格之间进行工艺转移的可能性。两种系统均已经过充分表征，并且数据可用，这些均可用于促进系统之间的工艺转移。

图 2. 在 ReadyToProcess WAVE 25 波浪式生物反应器系统或 XDR-10 搅拌罐生物反应器系统中使用 CDM4HEK293 培养基进行的 10 L HEK293 细胞培养中的 (A) 细胞生长、活力和 (B) 腺病毒滴度。

病毒释放和过滤

对 HEK293 宿主细胞裂解用去污剂的筛选表明，在混合条件下，在 37°C 下用 0.5% Tween™ 20 处理至少 2 h 可有效替代 REACH 授权列表（附件 XIV）中的 Triton™ X-100。液相色谱-质谱 (LC-MS) 方法用于测定残留的 Tween 20。为去除细胞碎片和初步减少杂质，使用了 2 μm 和 0.6 μm GF 滤器的组合。使用 NMWC 为 Mr 300000 的中空纤维滤器进行超滤/洗滤 (UF/DF) 可进一步减少杂质，同时为后续下游纯化步骤准备含腺病毒的样品。

病毒滴度的测定

采用两种基于表面等离子共振 (SPR) 的试验测定腺病毒浓度：一种基于病毒通过纤维蛋白与柯萨奇腺病毒受体 (CAR) 的结合，另一种基于病毒通过六邻体蛋白与因子 X (FX) 的结合。新分析方法与已建立的技术并行使用，以进行比较并确保准确监测处理材料（图 3）。SPR 试验具有稳健性，并提供了与 qPCR 相关性良好的可重现结果，同时显示出较低的差异性。

图 3. 使用 Biacore CAR 试验、FX 试验或 qPCR 对来自 10 L 规模腺病毒生产工艺不同步骤的样品的病毒滴度测定比较。

下游纯化

下游工艺经过精心优化，以满足产品纯度和质量方面的严格法规标准。由于腺病毒颗粒带负电荷，对于捕获步骤，阴离子交换填料是一个有吸引力的选择。然而，DNA 也能与阴离子交换剂强烈结合，并且使用填料筛选中包括的大多数阴离子交换剂时，DNA 可与腺病毒共洗脱。针对捕获步骤，对 11 种不同阴离子交换层析吸附剂进行了筛选。其中，Capto Q ImpRes 显示腺病毒结合载量最高。Capto Q ImpRes 也是在捕获步骤中对 DNA 清除率足够高的唯一阴离子交换剂，使 Capto Core 700 成为精纯步骤的可行选择。

Capto Core 700 并非专为去除全长 DNA 而设计，使得尺寸排阻层析 (SEC) 具备一定优势，但工艺经济计算表明，与 SEC 方法相比，使用 Capto Core 700 进行精纯更有优势，主要原因是样品上样量可能更高。成品分析结果表明产品符合设定标准（表 1）。

表 2 最终纯化原液的结果符合标准

结果为三次工艺运行的平均值。IVP = 传染性病毒颗粒，TVP = 总病毒颗粒，LOD = 检测限。免责声明：IVP 和 TVP 的分析方法可能存在差异，这会影响回收率和 IVP/TVP 比率的结果。

工艺经济考虑因素

开发工作离不开工艺经济考虑因素，而新型腺病毒工艺已显示出优于参考工艺的优势（图 4）。使用 BioSolve™ 工艺经济模拟工具 (BioPharm services) 进行了工艺经济模拟，并在各种工艺规模和滴度组合之间比较了每个批次和每剂病毒的成本。结果表明，与参考工艺相比，所述工艺通常是最经济高效的替代工艺。尽可能使用一次性设备的工艺配置通常也比主要使用不锈钢设备的相应配置更经济高效（图 5）。

 

图 5. 针对单一产品情景、不锈钢、一次性和混合配置进行的研究滴度和工艺规模之间的批次成本比较。

结语

病毒载体受到的关注日益增加，它们在基因疗法及预防性或治疗性疫苗应用中有着广阔前景，但也伴随着一系列挑战。需要足够的产能以满足市场需求，扩大产品管线需要采用平台方法进行生产，需要改进纯化和分析方法以确保经充分表征的产品具有高纯度、高有效性和高安全性。

尽管腺病毒是所述腺病毒生产工艺的重点，但该工艺也可能用于纯化其他病毒载体。新工艺具有可放大性，并能与可蒸汽处理的一次性硬管道工艺设备兼容。与使用固定不锈钢设备相比，通过省略原位清洁、原位蒸汽操作和相关验证程序，一次性设备可在同样时间内生产更多批次，并且可显著缩短生产批次或方案之间的转换时间。一次性设备还能够尽量降低不同生产方案之间的交叉污染风险。

结果表明，该新工艺是所有研究规模和情景下腺病毒生产的经济高效替代方案，可用于腺病毒的工业生产（例如，用于临床应用），并且所得产品符合法规标准。

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参考文献

1.Roots Analysis (Gene therapy market, 2015–2025 (2015).