切向流过滤和尺寸排阻层析分离外泌体

外泌体的生产

在所示的三个示例中使用了表达外泌体的三种细胞系：

1. 在 VivaZome 使用 RoosterBio 人间充质干细胞 (hMSC)、RoosterNourish 扩增培养基和 RoosterCollect EV 收集培养基，产生富含外泌体的细胞上清液。
2. 由 Evox 提供的产生 GFP 外泌体的 Cytiva 羊水细胞生产细胞系 (CAP™)。
3. Cytiva 的产生外泌体的人胚肾 293细胞 (HEK293)。
   
    

收获和澄清

对所有细胞上清液进行离心以去除细胞碎片（以 2500 × g 离心 10 min）。

初始外泌体富集和浓缩（TFF，包括使用 核酸酶对宿主 DNA 进行降解）。

在所有三个示例中，在剪切速率为 4000 (TMP 0.4 bar, 5.8 psi, 0.04 MPa) 的 ÄKTA flux S TFF 系统上使用 MWCO 为 750 kDa 的超滤 (UF) 滤芯 (Cytiva) 进行外泌体浓缩和缓冲液更换。使用 PBS（pH 7.4）进行 10 倍浓缩和 5 倍洗滤。在工艺结束时，向浓缩的外泌体截留液中加入 核酸酶(2 kU + 1 mM MgCl2) 并孵育 2 h。最后进行洗滤（ PBS，10 倍）以去除降解的 DNA 残基，见图 2。将外泌体浓缩 10 倍后使用superSEC 层析柱进一步纯化。

图 2. 使用TFF浓缩外泌体溶液、缓冲液更换和 核酸酶处理。

尺寸排阻层析 (SEC)

使用 Cytiva™ superSEC 和 Sepharose™ CL-2B 填料进行 SEC。在示例 1 中，两种填料均按照标准填充说明填充在 Tricorn™ 10/200 柱子中。按照标准填充说明，还将 superSEC 填料填充在柱床高度为 20 cm 的 HiScale™ 26/40 层析柱中。在示例 2 和 3 中，将两个 HiScreen™ superSEC 层析柱串联连接，得到柱床高度为20 cm的层析柱用于小规模纯化。用 superSEC 填料填充 HiScale™ 26/40 层析柱以进行大规模纯化。样品体积和流速见表 1。所有操作均在 ÄKTA pure™ 25 层析系统上进行。

表 1. 填充 superSEC 填料的层析柱上使用的运行条件；使用ÄKTA pure™ 25 层析系统

分析方法

分光光度法分析（UNICORN™ 软件）：在 ÄKTA pure™ 25 层析系统上分别以 260、280 和 490 nm 吸光度进行在线分析。

纳米粒子跟踪分析 (NTA)。使用 Z-NTA ZetaView (Particle-Metrix) 仪器对从浓缩和富集步骤中采集的样品进行 NTA 分析，以测定颗粒浓度和粒度分布。

ELISA 测定分析：按照生产商的说明使用人 CD63 ELISA 试剂盒 (EH95RB, Thermo Fisher Scientific)。

总蛋白浓度：Pierce™ BCA 蛋白测定试剂盒 (23225, Thermo Fisher Scientific)

DNA 含量：使用 Qubit ssDNA 测定试剂盒 (Q10212, Thermo Fisher Scientific) 测量样品中的 ssDNA 含量。

Western 印迹 (Wb)：在示例 1 中通过 Wb 分析对典型外泌体蛋白（如跨膜四蛋白 (CD9, CD63, CD81)）和腔蛋白（如 ALIX、TSG101 和同线蛋白-1）的表达进行定量测定。

在示例 2 中使用了跨膜蛋白 CD81 和细胞溶质蛋白 TSG101 的抗体。

外泌体形态：在示例 1 中，遵循广泛应用的阴性染色方案，使用 JEM-2100 (Jeol) 显微镜对浓缩外泌体制备液进行透射电子显微镜检查 (TEM)，以评估囊泡完整性和聚集。在示例 2 和 3 中，采用扫描电子显微镜检查 (SEM)，以检查外泌体的形态和大小以及杂质情况。

Sepharose™ CL-2B 和 superSEC 填料的填充

Sepharose™ CL-2B 填料的特性仅允许在重力流下进行装填。说明见此处：

Cytiva SuperSEC 填料适用于层析柱装填。

对于大规模层析柱装填，请按说明书操作

Cytiva™ superSEC 填料也可通过我们的定制 ReadyToProcess 产品预装在 ReadyToProcess™ 层析柱中或预装在科研级别的层析柱中。联系您当地的 Cytiva 代表以获取更多信息和指南。

使用 RoosterNourish 扩增培养基和 RoosterCollect EV 收集培养基产生富含外泌体的细胞上清液。该项研究由 VivaZome 开展。

使用 hMSC 产生富含外泌体的细胞培养上清液 (CCS)，这也是多家外泌体生产公司和学术研究小组使用的外泌体来源。hMSC 是临床试验中常见生产细胞类。

在洗滤步骤中使用截留分子量 (MWCO) 为 750 kDa（表面积为 73 cm2）的 TFF 中空纤维膜滤芯 (Cytiva, UFP-750-E-H42LA)。具体程序参见材料和方法。去除已消化的 DNA 和小核酸。利用 Qubit ssDNA 分析试剂盒 (Thermo Fisher Scientific) 对 核酸酶处理前和处理后培养基/透过液进行核酸（宿主 DNA 含量）分析（ÄKTA flux™ S TFF 系统）。核酸酶处理前培养基显示核酸浓度为 24 ng/mL，而核酸酶处理后用于 SEC 的样品的核酸残留量低于检测限（DNA 分析的下限为 1 ng/mL）。我们获得了 10 倍浓缩、回收率为 100%的外泌体（无靶物质损失）。

TFF 后样品中的 hMSC-外泌体浓度为 2.2 × 1010/mL（浓缩 10 倍）。从 SEC 运行中收集组分并用 NTA 分析，参见图 3 C–D。各收集 4 mL 的组分，峰 1（F3；早期峰）和峰 2（F5；后期峰）见图 3。从 superSEC 运行中收集的组分峰 1 的 4 mL 体积组分含有 5.17 × 109 个/mL 或总计 2.07 × 1010，占起始颗粒数的 47%。图 3 C–D 显示，使用 Sepharose™ CL-2B 和 superSEC 填料纯化hMSC外泌体收集组分分布最为集中，且蛋白污染水平相对较低（用 BCA 测定法进行分析）。

图 3. 分别用 (A)  Sepharose™ CL-2B 的 Tricorn™ 10/200 和 (B) superSEC 填料进行 hMSC 纯化运行的代表性层析图谱。F = 4 mL 组分。左侧峰含有 hMSC-外泌体，而在右侧峰中发现蛋白和 DNA 杂质。分别用 Sepharose™ CL-2B 的 Tricorn™ 10/200 (C) 和 superSEC 填料 (D) 纯化收集组分的颗粒和蛋白分析。

基于数据和与 Sepharose™ CL-2B 填料相比，superSEC 具有更高流速/压力特性，superSEC 是 Sepharose CL-2B 的改进版。EV的回收率相似，但如果考虑速度、磁珠刚性和可放大性等因素，superSEC 的效率更高。在本研究中使用的条件下，superSEC 的运行时间仅为 50 min，流速为 38 cm/h，而相比之下，使用 11 cm/h 的流速的 Sepharose™ CL-2B  的运行时间要长的多，为 180 min，（图 3 A–B）。较短的运行时间在处理较大体积料液时具有显著优势。

HiScale™ 26/40 层析柱中的 superSEC 填料的放大

对于使用 HiScale™ 26/40 superSEC 层析柱（柱床高度为 20 cm）进行的较大规模实验，我们使用 12 mL TFF 浓缩材料的样品上样量进行了四次连续运行。superSEC 填料的最大 hMSC-外泌体回收率为 66%，收集的浓度为 4.56 × 1010 个/mL（图 4）。运行时间为 50 min，流速为 34 cm/h。

图 4. (A).填充在 HiScale™ 26/40 层析柱运行中的 superSEC 的层析图谱。(B).各组分中的颗粒浓度和蛋白浓度。

外泌体结构、形态以及 Western Blot分析

分析 hMSC-外泌体浓度最高的样本，并测定外泌体含量，观察形态，同时通过 WB测定外泌体蛋白表达。

进行透射电子显微镜检查 (TEM) 以评估用层析柱纯化的外泌体的结构和完整性。完整外泌体的代表性图像及其特征性典型杯状形态结构和形态见图 5。

图 5. 显示用戊二醛固定并用 superSEC 纯化后醋酸双氧铀染色的完整 hMSC-外泌体的 TEM 图像（放大 20,000×）。

来自 WB 分析的图像（图 6）证实 hMSC-外泌体表达 CD9（尽管水平较低）、CD81、同线蛋白和 TSG101。这些目的蛋白在 hMSC-外泌体上的表达均低于阳性对照 Sy5Y 中观察到的表达，后者每个泳道的蛋白上样量是前者的两倍。

图 6. WB显示superSEC 装填的 HiScale™ 层析柱纯化的外泌体表面存在外泌体特异性蛋白。蛋白上样量为 1.5 µg 外泌体和 3 µg Sy5y 外泌体阳性对照。

在本工艺方案中，使用 Cytiva 羊水细胞生产 (CAP™) 细胞系生产具有绿色荧光蛋白 (GFP) 标签（与外泌体表面的 CD63 相连）的外泌体，以便进行荧光检测。为保证良好的重现性，使用 TFF 对 GFP-外泌体 CAP™ 细胞上清液（CCS） 进行两次单独富集，然后使用 superSEC 纯化。与示例 1 一样，进行了两种规模的纯化—两个 HiScreen™ 层析柱和一个柱床高度为 20 cm 的 HiScale™ 26/40 层析柱，详情参见材料和方法 中的表 1。测定了回收率和外泌体浓度，包括颗粒 (NTA)、CD63 (ELISA)、总蛋白和 ssDNA 含量分析。进行 WB和 SEM，作为对收集的组分中颗粒鉴别的最终确认。

收集组分，并使用 NTA、ELISA CD63、BCA 和 Qubit ssDNA 测定试剂盒进行分析。通过对从 SEC 收集的组分进行颗粒测量（NTA，参见图 7），确认外泌体保留在第一个峰中，并通过图 7 A–B 和 ELISA CD63（未显示数据）中层析图谱中的 A490 nm 检测证实。峰 2 上 BCA 测定的蛋白含量分析表明，使用 superSEC 填料去除了更多的蛋白（图 7 C–D），表明单独使用 TFF难以做到去除所有宿主蛋白。结果也与示例 1 中 hMSC 外泌体纯化所得结果一致。

为进一步确认采集的组分中存在外泌体，使用抗 CD81 和 TSG101 抗体进行了 WB 分析，并使用 SEM 进行了电子显微镜分析。WB 结果（图 9）确认这些组分表达了 CD81 和 TSG101，但可能由于 SEC 组分中的浓度较低，仅在 TFF 后的料液中检测到 TSG101。

SEM 分析图像（图 10）显示存在具有经典杯状形态的囊泡，TFF-SEC 工艺去除了杂质。

图 7. CAP™ CCS 在 (A) 串联的 HiScreen™ superSEC 层析柱和 (B) superSEC 的 HiScale™ 层析柱上运行的层析图谱。样品：TFF 截留的 GFP 外泌体。(C) HiScreen™ 和 (D) HiScale™ superSEC 层析柱中各组分的颗粒浓度和蛋白浓度。

图 8.  ssDNA 含量测定结果显示出DNA的去除。样品为CAP™ 上清液中浓缩和纯化的GFP 外泌体。

图 9. CD81 的 WB 结果表明，在工艺的所有步骤中均存在 CD81。经过 HiScreen™ superSEC 层析柱后的 CAP™ 细胞来源的 GFP 外泌体除外。

图 10. CAP™ 细胞 GFP 外泌体分离不同步骤的 SEM 图像。黑色箭头表示外泌体样结构，白色箭头表示非外泌体结构。(A) 收获料液，(B) TFF 750 kDa MWCO 截留液体。(C) HiScale™ superSEC 层析柱纯化后。

在本示例中，我们从用Cytiva 的 HEK293 细胞系生产并纯化外泌体。首先将 250 mL HEK293 CCS 样品上样至 TFF 中空纤维膜（使用 750 kDa MWCO），以去除 HCP 和 DNA（根据材料和方法 中描述的方法）。与其他两个 CCS 的示例一样，使用 核酸酶处理，但未对 HEK293 样品进行 DNA 分析。例如，对于 hMSC 和 CAP™ 样品纯化，我们开发了两种规模的 superSEC 填料纯化（参见材料和方法 中的表 1）。测定了回收率和外泌体浓度，包括纳米粒子跟踪分析 (NTA)、CD63 (ELISA) 和总蛋白分析。进行 WB 和扫描电子显微镜 (SEM) 作为检测外泌体的最终确认。

去除了约 92% 的蛋白（BCA 测定法分析）。根据 NTA 分析，TFF 后保留的颗粒为起始的 74%。通过 CD63 ELISA 测定，外泌体回收率为 54%。

然后将 TFF 外泌体样品进行层析。 HiScreen™ superSEC 层析柱上样量为1 mL，HiScale™ 层析柱上样量为15 mL。在图 11 A–B 中的层析图谱中，可见两个峰，与加载 hMSC 外泌体和 CAP™ TFF 样品时一致。HiScreen™ 和 HiScale™ 层析柱的运行时间也与 CAP™ TFF 样品的运行时间相同，因为使用的流速相同，分别为 20 min（流速 129 cm/h）和 45 min（流速 45 cm/h）（参见图 11）。考虑到层析柱的平衡和清洁，一次运行的处理时间将分别为 1 h 和 2 h。

收集层析运行的组分，并使用 NTA、ELISA CD63 和 BCA 测定法进行分析。在图 11 C 中，基于 NTA 数据，很明显外泌体保留在第一个峰中，这也通过 ELISA CD63 分析得到确认（未显示数据）。HiScreen™ 和 HiScale™ 层析后外泌体颗粒的回收率分别为 51% 和 61%。同样在本示例中，使用 superSEC 去除蛋白（图 11 C–D）。NTA 分析还表明，在整个工艺中，外泌体颗粒的平均尺寸（150 至 160 nm）无显著差异。

我们使用针对 CD81 和 TSG101 产生的抗体进行了 WB 分析（图 12）。对HiScreen™ 和 HiScale™ 层析柱中 superSec 纯化后的组分进行 SEM 分析（图 13），以确认外泌体含量。

SEM 图像显示存在具有经典杯状形态的囊泡，并且在不同步骤中去除杂质。WB 分析确认这些囊泡表达了 CD81 和 TSG101，可能由于 SEC 运行后组分中的浓度较低，仅在 TFF 截留液中检测到 TSG11。

图 11.  (A) 用 HiScreen™ superSEC 层析柱纯化的 HEK293 CCS 的层析图谱和 (B) 用 superSEC 填料填充的 HiScale™ 层析柱中的层析图谱。(C) HiScreen™ 和 (D) HiScale™ 层析柱运行中各组分的颗粒浓度和蛋白浓度。

图 12.  CD81 的 WB 结果表明在分离工艺的所有步骤中均存在 CD81。

图 13. HEK293 细胞上清液外泌体纯化的 SEM 图像。

三个 CCS 示例的结果表明，Cytiva™ superSEC 填料非常适合用于 TFF 后的外泌体纯化步骤，可去除较小的杂质（如蛋白），同时该填料的优点还在于改进了压力-流动特性，使得填料易于在大规模层析柱中填充，并缩短 SEC 循环时间。与使用 Sepharose™ CL 2B 填料相比，该填料将工艺循环时间缩短了数小时，还可以在合理时间范围内执行多个 SEC 循环。

Cytiva™ superSEC 填料是 Capto™ Core 填料提供的用于外泌体纯化的成熟多模式层析方法的补充。虽然 Capto™ Core 填料相比 SEC 允许的样品体积更大，但 SEC 的优势在于，可从层析纯化中收集任何组分，并可洗脱所有杂质，使用等度梯度再生填料以进行另一个层析循环。

除了工艺放大，使用 Cytiva™ superSEC 填料的 TFF 和 SEC 的下游外泌体工作流程，相比使用 Sepharose™ CL-2B 填料的 SEC，外泌体的纯度指数更高。纯度指数是外泌体颗粒数量与蛋白和 DNA 杂质量之间的比值。来自三种不同 CCS 的三份样品显示了superSEC富集外泌体和去除杂质的性能。我们得出的结论是，对于两种不同规模和三种 CCS，使用 Cytiva™ superSEC 填料均可提高纯度指数。

我们发现在 SEC 步骤中外泌体与蛋白能实现效果不错的分离。囊泡先经过填料，蛋白被保留并收集在后期组分中。外泌体浓缩与 TFF 的结合以及 superSEC 填料的流动特性，方便客户使用相对较小的层析柱，通过重复层析循环来实现较大体积的外泌体纯化。

总结来说，用 TFF 和 SEC 纯化是一种从外泌体中清除 HCP 和 DNA 的温和方法。Cytiva superSEC 填料可缩短层析循环时间，并可在有限的时间范围内进行多个 SEC 层析循环。TFF 可初步去除大部分杂质，样品浓缩后可采用 SEC 进一步有效减少杂质。

• 我们并未测试多种流速，但我们观察到，使用柱床高度为 20 cm (106 mL) 的 HiScale™ 26/40 层析柱，4 mL/min 的流速可以实现外泌体回收率 > 50%。我们在 12.5% CV 下上样获得了出色的分离度。最初，我们尝试以 25% CV 上样，但较高样品上样量影响了分离度。
  
   

• 我们使用柱床高度为 20 cm 的 HiScale™ 26/40 层析柱，以 4 mL/min (45 cm/h) 的流速运行，上样量 15 mL (14.2%)，得到了不错的结果。由于样品限制，我们尚未使用 HiScale™ 层析柱检测更高的流速，但根据我们在较小规模下运行的数据（未显示数据），或许可在已有数据的基础上提高流速。我们还在串联耦合的两个 HiScreen™ 层析柱（柱床高度为 20 cm，柱床体积为 9.4 mL）上以 1 mL/min (128 cm/h) 的流速运行，同样得到了令人满意的结果。

1. Zhang X, Borg EGF, Liaci AM, Vos HR, Stoorvogel W. A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity. J Extracell Vesicles. 2020 Jul 14;9(1):1791450. doi: 10.1080/20013078.2020.1791450.

本应用说明中的数据是与澳大利亚的 VivaZome Therapeutics Pty Ltd 和英国的 Evox Therapeutics Ltd 合作生成的。

以下人员对本应用说明作出了贡献：

Cytiva：Jon Lundqvist、Inger Salomonsson、Peter Guterstam、Jagan Billankanti、Sofie Hellsten 和 Vincent Goijenfalk。 
Vivazome：David Haylock 和 Mitch Shambrook。

CY38458-150224-AN

• Cytiva™ superSEC 填料
• HiScale™ 26/40 层析柱
• 切向流过滤器
• 细胞培养基和缓冲液
• 用于收获的 NFF 过滤器
• ÄKTA pure™ 层析系统
• ÄKTA avant™ 层析系统