目前，全球对生物制药的需求超过 3000 亿美元，预计每年至少增长 12%。生物制药行业增长较快的领域有mRNA 和病毒载体，高质量、可靠的质粒 DNA来源 (pDNA) 至关重要。基因治疗和 DNA 疫苗通常需要超螺旋百分比超过 80% 的临床级 pDNA (1)。
生物工艺应用中使用的质粒通常在 5 - 20 kb。本文使用一次性、可放大的两步法纯化7.3 kb 的模型质粒，并证明两步法可显著缩短工艺时间、提高可持续性。
简介
在生物应用领域，pDNA 是用于克隆、扩增或表达基因的一种重要的基因工程工具。符合药品生产质量管理规范 (GMP) 等级的 pDNA 有很多应用，包括 DNA 疫苗和基因治疗，同时，病毒载体和 mRNA 的生产也依赖于 pDNA (1)。
本研究的主要目的是设计一种比三步法效率更高的纯化工艺。图 1 是工艺概述，包括使用 Mustang™ Q XT 膜层析捕获、Capto™ PlasmidSelect 纯化超螺旋 (sc) pDNA。使用 Mustang™ Q XT 膜层析的好处是，与具有相同配基的填料相比，结合载量显著提高。这是因为pDNA 的尺寸大小难以进入磁珠的内部空间，磁珠上衍生的配基有很大一部分无法与 pDNA 结合，这严重影响了结合载量。
除了更高的结合载量外，Mustang™ Q XT 膜层析还支持对流，显著提高了生产效率。两步层析工艺符合大规模监管生产要求，并可放大到 50 L 发酵规模。图 2 是与三步法的比较。
图 1. pDNA 的工艺概述。上方是两步法，下方是三步法
图 2. 50 L 规模的 pDNA 下游经济效益计算表明，新工艺显著缩短了工艺时间并提高了可持续性。
上游和中游考虑因素
为了达到工艺目标，必须考虑从发酵到最终过滤的全流程。例如，在发酵过程中，过量添加消泡剂或补料导致甘油蓄积，可能会影响开环 (OC) pDNA 与超螺旋 (SC) pDNA 的比例。此外，裂解参数对于提高工艺效率也至关重要，既能最大程度提高产率，又能保持 pDNA 的稳定性并降低宿主细胞蛋白 (HCP)、内毒素和基因组 DNA (gDNA) 的水平，注意避免 gDNA 断裂。裂解后碳酸氢铵絮凝前加入 CaCl2 进行沉淀，可有效降低 RNA 水平。以上步骤对于下游工艺的成功至关重要。
图 3. 采用 Mustang™ Q XT 膜层析进行高载量快速层析循环。(A) 实验室规模 Mustang™ Q XT5，载量为 12 mg/MV（膜体积），收率为 58%。(B) 生产规模级别的 Mustang™Q XT140，载量为 8.95 mg/MV，收率为 67%。
图 4. 使用 Capto™ PlasmidSelect 去除 OC pDNA。(A) 实验室规模 Capto™ PlasmidSelect 18 mL，载量为 2.8 g/L，上样流速 220 cm/h ，洗脱流速120 cm/h，收率为 77%。(B) 生产规模 Capto™ PlasmidSelect 1 L，采用 ReadyToProcess™ 预装柱，载量为 0.85 g/L，上样流速 179 cm/h，洗脱流速 90 cm/h，收率为 72%。
结果和讨论
所介绍的工艺最初是使用 15 L 不锈钢发酵反应器开发的，后来使用 XDR50 一次性反应器放大到 50 L。下游工艺包括使用 Mustang™Q XT140 膜层析捕获 pDNA（图 3）。随后使用 Capto™ PlasmidSelect 去除 OC pDNA（图 4）。工艺收率见表 1。
表 1. 工艺参数
| 组分 | 组分近似重量 (g) | 浓度 (mg/mL) | pDNA (mg) | 该步收率 (%) | 总收率 (%) |
| 裂解物 | ~120 000 | 0.01 | 1411 | 不适用 | 不适用 |
| UF/DF HF（500 Mr，1.15 m2） | ~9 000 | 0.14 | 1303 | 92 | 92 |
| NFF（0.5 µm，载量 2018 L/m2） | ~9 000 | 0.14 | 1277 | 98 | 90 |
| Mustang™ Q XT140 洗脱 | ~2 000 | 0.40 | 854 | 67 | 60 |
| Capto™ PlasmidSelect 洗脱 | ~4 000 | 0.15 | 618 | 72 | 44 |
| 最终 UF/DF HF（500 Mr，290 cm2） | ~500 | 1.04 | 482 | 78 | 34 |
| 最终 0.2 μm 除菌过滤 | ~400 | 1.04 | 442 | 92 | 31 |
DF：洗滤
HF：中空纤维
NFF：死端过滤
UF：超滤
分析
在整个工艺中，对样品进行了全面的分析。一次性两步工艺符合 FDA 指导原则（表 2）。使用 Capto™ PlasmidSelect 的嗜硫亲和层析也可用于工艺样品的分析，尽管该实验没有采用正交技术，但其性能与毛细管凝胶电泳 (CGE) 相当，如表 3 所示 (2)。
表 2. 生产规模 pDNA 工艺符合 FDA 指导原则
| 组分 | SC pDNA (%) | 大肠杆菌 DNA (µg gDNA/mg pDNA) | 大肠杆菌 HCP (µg HCP/mg pDNA) | 内毒素 (EU/mg pDNA) |
| 裂解物 | 91 | 16.4 | 2 789 | 2 581 641 |
| UF/DF | 98 | 1.0 | 7.7 | 122 |
| NFF | 97 | 1.7 | 5.1 | 87 |
| Mustang™ Q XT140 洗脱 | 97 | 1.4 | < 1* | 4 |
| Capto™ PlasmidSelect 洗脱 | 99 | 0.5 | < 1* | < 7* |
| 最终 UF/DF | 99 | 0.6 | < 1* | < 1* |
| 最终过滤 0.2 µm | 100 | 0.6 | < 1* | < 1* |
| 可接受标准 (Cytiva) | > 95 | < 2.0 | < 1.0* | < 10 |
| 可接受标准（美国 FDA）† | > 80 | < 10 | < 1.0* | < 40 |
| 属性 | pDNA 质量 | 大肠杆菌 残留 DNA | 大肠杆菌 HCP | 内毒素 |
| 方法 | Capto™ PlasmidSelect | ddPCR | Gyrolab® 测定 | LAL 试验 |
* HCP 和内毒素的结果低于 LOQ，但设定为 LOQ，以便能够计算结果/mg pDNA
†质粒 DNA 疫苗用于传染病适应症的考虑因素 2005D-0047
HCP：宿主细胞蛋白
LOQ：检测限
UF：超滤
琼脂糖凝胶电泳 (AGE) 分析表明，在 UF/DF 之后，OC DNA 的水平几乎检测不到，并证明在裂解后采用 CaCl2沉淀步骤可有效减少 RNA（图 5）.
工艺选择
不同 pDNA 应用所需的质粒规模和数量各不相同。通过对纯化工艺进行优化，来满足所需的纯度和浓度。这种优化可能包括许多不同的参数和考虑因素，如工艺时间、可放大性、灵活性、工艺控制、批量成本 (OpEx)、占用空间、环境影响和废弃物处理。
选择下游工艺的另一个重要参数是上游补料。本研究中使用的补料在经过中游步骤后，SC DNA 含量已超过 90%。在这种情况下，富集 SC DNA 的 Capto™ PlasmidSelect 步骤可以作为去除内毒素的方法，而在初始补料含有另一种成分的情况下，富集 SC DNA 可能对达到所需的 SC DNA 百分比至关重要，每个工艺的参数和考虑因素通常不同。图 6 为满足特定质粒 DNA 要求的工艺选择提供了指导。例如，如果可放大、低内毒素、SC DNA 富集和低缓冲液消耗很重要，那么使用 Mustang™ Q XT 膜层析和 Capto™ PlasmidSelect 填料纯化 pDNA 的两步层析工艺就很有优势。
表 3. 使用 Capto™ PlasmidSelect嗜硫亲和层析的分析模式可对工艺样品进行快速分析以确定 OC/SC pDNA 比值。
| 组分 | SC (%)（Capto™ PlasmidSelect 法） | SC (%)（CGE 法） |
| Mustang™ Q XT140 | 97 | 97.9 |
| Capto™ PlasmidSelect | 99 | 98.9 |
| 最终过滤 | 100 | 98.8 |
1.裂解物
2.深层过滤
3.UF/DF
4.NFF
5.Mustang™ Q XT140
6.Capto™ PlasmidSelect
7.最终 UF/DF
8.0.2 μm 过滤
图 5. 质量控制（琼脂糖凝胶电泳 (AGE) 法）。
图 6. 两步和三步下游质粒纯化工艺的选择指南。
结论
新开发的两步法质粒纯化工艺可放大、符合 FDA 指导原则，且实现了以下目标：
- 裂解后通过 CaCl2 沉淀有效减少 RNA。
- 用 Mustang™ Q XT 膜快速捕获 pDNA，然后通过 Capto™ PlasmidSelect 填料对 SC pDNA 进行选择性纯化。
- 下游生产时间显著缩短，并且随着硫酸铵消耗量的降低，可持续性得到改善。
参见当前和新兴生物疗法的生物工艺策略以了解更多。
- Center for Biologics Evaluation and Research. Guidance for Industry: Considerations for plasmid DNA vaccines infectious disease indications. U.S. Food and Drug Administration. https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/considerations-plasmid-dna-vaccines-infectious-disease-indications
- Bennemo M, Blom H, Emilsson A, Lemmens R. A chromatographic method for determination of supercoiled plasmid DNA concentration in complex solutions. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2009 Aug 15;877(24):2530-6.