实验室成像中的噪声
噪声是一种多余的信号成分，它可以像干扰声音一样干扰成像。在图像中，噪声通常以光信号或电信号的形式出现，这些信号并非来自目标样品，而是来自测量仪器或背景。
电荷耦合器件 (CCD) 成像系统常在实验室中用于研究从细胞菌落到蛋白质印迹中蛋白条带的所有内容。这些系统包含 CCD 图像传感器芯片，可将光子转换为可量化的电信号，以产生数字图像（图 1）。
图 1. CCD 成像芯片的组件，以及撞击传感器像素的光子向用于形成数字图像的电信号的转换。当电荷充满每个光电二极管时，信号先传输到垂直串行寄存器，然后再传输到水平串行寄存器，最终转换为数字信号。
在整个 CCD 成像过程中，有可能引入以下几种噪声源：
- 光子噪声，由光子撞击像素的速率的自然变化引起。
- 暗噪声，CCD 成像仪的硅层内产生的热量的产物。热量产生电子，电子可以作为信号被检测到。
- 读噪音，由 CCD 上电信号量化过程中的错误导致。
对于蛋白质印迹，暗噪声和读噪声与来自印迹空白区域的非特异性背景信号或来自非靶蛋白的光子噪声不同。从最终图像中校正这些因素所需要的不仅仅是更改蛋白质印迹工作流程。
Amersham ImageQuant 800 成像仪可监控信噪比 (SNR) 并自动调整用于优化最终图像的操作，从而提供比传统 X 射线胶片检测更大的灵活性。
SNR 对实验室成像的影响
SNR 是衡量 CCD 图像传感器上每个像素检测到的信号是目标区域的真实信号还是背景噪声的参考依据。SNR 是衡量整体成像性能的指标。
对于蛋白质印迹，SNR 指印迹上每个条带的信号强度与局部背景噪声之间的比率。如果印迹包含相对弱的条带，与低SNR相比，高 SNR 意味着这些条带有可能被看见，从而有可能被量化。
SNR、检测极限和线性动态范围
SNR 与检测极限直接相关。简而言之，如果信号大于噪声，则更易于检测。量化足量样品的高信号通常同样重要。最弱条带和最大信号之间的范围定义了线性动态范围。线性动态范围是指成像设备检测到的信号强度与样品中蛋白质的含量成正比的区间（图 2）。高线性动态范围对于精确分析至关重要，因为它可以帮助确认和定量在不同条件下培养的细胞中发现的蛋白质水平的巨大差异。
图 2. 蛋白质印迹成像中的线性动态范围。印迹上的信号强度与样品中蛋白质的含量成正比。条带 1、2 和 3 覆盖了一定范围的信号强度，但仍处于图像的线性动态范围内。
动态范围的计算方法是：最大信号响应（如蛋白质印迹上最强条带所示）与最弱的可检测信号（或蛋白质印迹图像上的平均背景）的比率。
低动态范围可能会使在同一印迹上对高表达样品和低表达样品进行成像变得困难。信号强的条带更容易饱和，信号弱的条带更不容易在背景中被检测，从而妨碍准确的定量。
检测的上限和下限（检测极限，LOD）分别是信号过于饱和或过于微弱而无法可靠地进行定量的点（图 3）。
图 3. 检测极限表示信号变得太弱或太饱和而无法准确定量的阈值。
为何低噪声对成像有利？
最大限度地降低蛋白质印迹图像中的噪声有两个好处：
- 提高检测灵敏度和检测下限，从而增加检测到微弱条带的可能性。
- 扩宽线性动态范围，从而可对同一印迹上的弱条带和强条带同时进行成像和精确定量。
胶片与 CCD 成像中的 SNR
与数字 CCD 成像相比，胶片的动态范围窄且变化大。动态范围窄意味着强条带会很快变得饱和，而弱条带在短时曝光时不可见。动态范围也随曝光时间而变化，这意味着通常需要一定范围的曝光时间才能覆盖每个结果中的全谱的条带强度。
若要使用胶片定量蛋白质水平，需要使用台式扫描仪将曝光的胶片转换为数字图像。根据扫描仪的质量，此过程可能无法准确捕获整个范围的信号强度，从而进一步缩小了可用于分析的动态范围。
常规的 CCD 成像仪直接检测信号，省去了扫描步骤。数字 CCD 图像比胶片具有更宽的动态范围，但是成像过程通常仍需要曝光时间优化。
寻找 CCD 成像的最佳曝光时间
现代 CCD 数字成像系统提供了各种成像选项，但用户仍然经常需要使用试错法来找到实现最大 SNR 的最佳曝光时间。这个曝光时间也是在不同实验之间（甚至同一实验中）的一个变量。
增强型化学发光 (ECL) 是一种将蛋白质印迹可视化的最常见方法，它依赖酶促反应产生信号（该信号的强度会随着底物消耗而随时间变化），为此试错过程增加了另一个变量（图 4）。由于信号强度不断变化，SNR 也将不断变化，要找到最佳曝光时间变得既困难又费时。最终，信号会变得过于微弱而检测不到，印迹工作需要全部重复进行，或者通过剥离和重新探测进行。
图 4. 基于化学发光的蛋白质检测。辣根过氧化物酶 (HRP) 催化 ECL 底物转化为敏化试剂，该试剂进一步氧化后会产生激发态，当它衰变时会发出光 (428 nm)。
常规的 CCD 数字成像系统根据给定时间段内撞击每个 CCD 传感器像素的光子总量，生成具有一定强度的图像。有理由假设长时间曝光比短时间曝光产生的光子更多，信号更强，从而产生易于分析的图像。理论上，延长曝光时间也将增加检测到弱条带信号的机会。
但是，长时间曝光也会导致增强背景信号以及无意中使强信号饱和的风险。在常规 CCD 数字成像系统上，这可能使从同一印迹中捕获高强度和低强度信号变得困难。
不足为奇的是，近年来，人们一直在努力开发新的方法和算法，以自动确定最大 SNR 的最佳曝光时间。这些算法的变体可在市场上的几种 CCD 成像系统中找到，但这些单次曝光不太可能提供真正宽泛的线性动态范围。
进行单次曝光的一种潜在替代方法是使用不同曝光同时捕获高强度和低强度条带，并将它们堆叠起来，产生高动态范围 (HDR) 图像。这种方法需要对原始图像数据进行一定程度的更改或修改，并且可能在证明任何定量结果的准确性和可靠性方面带来新的挑战。
使用图像平均将噪声降至最低
图像平均的概念并不新鲜。在基于 CCD 的实验室成像中，图像平均提供了一种方法和机会，通过组合多次曝光的数据，在不改变或修改实际捕获的图像的前提下，实现 SNR 最大化。此方法基本上平均了帧之间的随机噪声，同时保留了真实信号的完整性。
图像平均可提供在蛋白质印迹上检测低强度条带所需的灵敏度，同时又不具有使高强度条带饱和的风险。在使用此方法时，也不需要试错，因为曝光将重复进行并与先前的数据进行平均，直到达到 SNR 峰值。
最终，图像平均方法大大增加了在检测极限内和宽泛的线性动态范围内保留蛋白质印迹上所有条带的可能性，从而无需重复实验或开发多个印迹。
Cytiva 提供了一系列优化蛋白质印迹成像和工作流程的解决方案。若要更深入地了解 CCD 成像背后的方法和原理，请访问 Cytiva 成像原理和方法指南。有关蛋白质印迹或 CCD 成像工作流程的任何方面的进一步支持和咨询，请联系 Cytiva 科学支持团队。