常见问题

如果您的实验目的是想获得精确的亲和力数值，那建议选择固定蛋白。考虑到小分子的固定难度、空间位阻以及固定过程对于结合的影响等方面的问题，选择氨基偶联的方式固定蛋白往往是最简单、有效的固定方式。

  1. 进行蛋白与小分子互作实验时优先考虑直接偶联蛋白的方式，主要看分子量比值差异。
  2. 以下情况也可尝试捕获法
    • 待固定的样品未经纯化，含有其他杂质；
    • 担心直接偶联的过程会影响结合位点等。
    • 常用的捕获类芯片以NTA芯片为例，这是一种可以通过螯合镍离子捕获带有His标签蛋白的捕获芯片。NTA芯片上捕获量大约在3000 – 4000 RU最为稳定，非常适合His标签蛋白与小分子二者分子量差异不是特别大的亲和力检测。
  1. 当蛋白与小分子的分子量比值大于100时，建议考虑换用CM7芯片。
  2. 具体使用芯片的类型及使用量可参考下图：

  1. 蛋白与小分子结合反应的KD值，基本都在μM级别，因此可以将小分子最高浓度设为1000 μM，按照3倍甚至5倍的稀释比例来配制浓度梯度（拉大范围）。
  2. 进行初步实验后，基本可以确定反应KD值的大致范围，后续可以调整浓度范围、减小稀释比例再进行进一步实验。
  3. 当然，小分子能够达到的最高浓度还受到溶解度等因素的影响。
  1. 按照最常用的分析物在5%的DMSO中为例：对含有5% DMSO的样品以4.5% - 5.8%的范围进行溶剂校正，最终得到的溶剂校正曲线横坐标范围一般要落在-500 到 +1200 RU，校正曲线图谱中的两条竖线代表的是分析物中DMSO浓度范围，要求落在校正曲线的范围内，并且拟合的Chi²值小于2。
  2. 如果溶剂校正的结果出现异常，可以留意以下几方面的问题：
    • 建议使用高品质的DMSO试剂，并且使用相同来源的DMSO溶解小分子和配制所需溶液。
    • 注意校正溶液的配制策略，例如只需配制含4.5%和5.8% DMSO的这两种缓冲液，中间梯度通过这两种溶液按照不同比例混合得到，而不需要一个个单独配制
    • 由于DMSO具有吸潮的性质，在配制过程中应及时封闭，避免长时间敞口放置
    • 在上机检测时，也应该对样品管进行密封。Biacore独特的全密闭样品舱设计，及配套专用的孔板封膜及EP管橡胶盖就在此刻表现效果极佳。

可以使用Biaocre来检测，也需要做溶剂校正，做法和DMSO一致，但要注意乙醇较易挥发问题，配置试剂要迅速。

  1. 置换buffer，置换掉高折光物质
  2. 稀释倍数在100倍以上，可以先进样试试，当然最好还是要置换buffer。

Biacore具有溶剂矫正功能，对于需DMSO助溶的小分子样品，同样在running buffer中加入与分析物中相同浓度的DMSO，通过溶剂矫正即可获得真实结果。