Percoll

Percoll/Percoll PLUS 在生产过程中是经过高温灭菌处理的，但是由于瓶子的材质问题，只能在 113℃ 条件下进行，持续时间为 1 h。目前在官方说明书中不再申明 Percoll/Percoll PLUS 为无菌的。如果对灭菌要求较高，可以进一步灭菌，条件是 120℃，30 min，但需要从原包装瓶中转移出来。Percoll 溶液的高压灭菌必须在没有盐和蔗糖时进行（建议只对原液灭菌）。

Percoll 的配制一般有两种方法：

  1. 按照百分比用两步法计算：用一份的 1.5M NaCl 或者 2.5M 蔗糖加九份 Percoll 原液，得到 100% 的 SIP 溶液。在此基础上，比如想要得到 44% 和 67% 的工作液，分别按 0.15M 的 NaCl 或者 0.25M 的蔗糖：SIP=（100-44）：44 和（100-67）：67 的比例取相应体积的溶液进行配制即可。
  2. 根据密度进行一步法计算，该计算方法需要知道最终配制的溶液的密度、细胞分离液的密度（Percoll 密度范围 1.130.005 g/ml，具体密度可根据批次号在英文官网中查询 COA 获得），以及用于稀释的 buffer 的密度（1.5M 的 NaCl 密度为 1.058 g/ml，2.5M 的蔗糖的浓度为 1.316 g/ml），推荐官网的计算小程序，链接如下：

    https://www.cytivalifesciences.com.cn/zh/cn/support/online-tools/cell-preparation/Percoll-calculator

    图1

Percoll 的应用领域很广，涉及多个物种多种细胞类型，还可以分离亚细胞结构，有广泛的文献支持。当客户询问能否做某些应用时，可对照下图查询是否可以应用。

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Percoll 在没有被打开时，在室温下可以保存 5 年，打开后应该保存在 4℃-8℃，尽快用完。Percoll 可以冷冻保存在-18°C 中 6 个月，如果保存在-18°C，在融化时会形成梯度，在使用前必须混合瓶中的内含物。

目前有如下所示细胞类型和浮力密度供参考：

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  1. 制备 SIP：对于普通的细胞，将 9 份 Percoll 加入到 1 份 1.5M NaCl 或 1 份 10×浓缩培养基中，通过加盐或者蒸馏水可以最终调节到所需要的渗透压；对于有盐存在时会发生聚集的亚细胞颗粒，可以通过添加 9 份 Percoll 到 1 份 2.5M 的蔗糖中来制备 SIP（制成的 SIP 可以理解为 100% 的 Percoll，也有文献中将 SIP 理解为 90% 的 Percoll，具体看文献中的做法）
  2. 稀释到终浓度：对于细胞，可以添加 0.15M 的 NaCl，对于亚细胞颗粒或病毒则添加 0.25M 的蔗糖。最终按照比例进行稀释，得到不同百分比的分离液。

Ficoll

根据细胞密度的不同进行分离。单个核细胞的体积、形状和比重与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞比重较大，为 1.092 左右，淋巴细胞和单个核细胞比重为 1.075 左右。利用 Ficoll 作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集：血浆和血小板密度较低,，悬浮于分离液的上部；红细胞与粒细胞密度较大，沉于分离液的底部；PBMC 密度稍低于分离液，位于分离液界面之上，移去上层组分就可获得 PBMC。

Ficoll 被用作从外周血、骨髓及脐带血中分离高活性的单个核细胞（包括淋巴细胞和单核细胞）

  1. Ficoll-Paque PLUS 主要用于人外周血中淋巴细胞的分离，如果待分离的淋巴细胞来自其他的组织/种属，可能无法获得淋巴细胞的最佳产量和纯度，需要对标准操作进行优化。
  2. 已有在鼠、狗、猴、牛、兔、马、猪甚至鱼淋巴细胞分离上的应用，具体操作条件可以查询对应文献（在 Ficoll 操作手册上提供了文献）。
  3. 不满足条件的种属或来源，可以先用 Ficoll 分离出单个核细胞，再加一步 Percoll 来实现最终的分离目的。

Ficoll 已经在 121℃、20 min 进行了灭菌，为无菌状态，建议无菌操作，分次取用即可。再次灭菌的话由于客户的灭菌设备等的差异，没有推荐的灭菌条件。另外如果灭菌时没有保证盖子的密封性和稳定的温度，可能会造成 pH 波动。

Ficoll应避光储存于 4-30 °C 之间，在该条件下可以保存 3 年。打开后建议存储于 4-8℃。偶尔短时冷冻，解冻后来回反复倒置，确保溶液的均一。

分离时一般都用塑料管，长期储存因为需要避光，不适合用来储存。Ficoll 有泛影酸钠，需要避光。可以用塑料瓶+锡箔纸短期储存（两周）。

离心完成后，从管底往上依次为红细胞-粒细胞-Ficoll 细胞分离液-淋巴细胞-血小板-血浆。在取淋巴细胞时要小心将上层的血浆和血小板移除后再吸取淋巴细胞。

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  1. 按照样品：Ficoll 的高度比约为 3:2.4 或体积比 4:3 的比例进行样品和分离液的添加。
  2. 大体积样品可以通过增加离心管的直径来进行分离。增加离心管直径并不影响所需的分离时间。