protein A

首先根据不同的种属亚型参考“相对结合强度”表（如下图），Protein A和Protein G 均结合抗体的重链部分，若存在 Protein A 及 Protein G 都有较强结合能力时， 更加推荐 Protein A。 Protein A 的洗脱条件（pH 3.5–4.5）较 Protein G（< pH 3）更加温和，利于对低 pH 敏感抗体的稳定性。 另外， Protein A 有耐碱清洗的 PrismA或 SuRe 配基可供选择，且载量更高。 尤其是纯化多个抗体，为了避免交叉污染，优先推荐耐碱清洗的填料，长久使用更经济。

Protein G Sepharose 来源于链球菌， 为细胞表面的 III 型 Fc 受体。 可以广泛、更强地结合更多类型的IgG、 多克隆 IgG 及人 IgG。同时， 重组表达的 Protein G 去除了 N 端白蛋白结合结构域， 血清蛋白结合水平更低。 此外，Protein G 还可以和某些抗体的 Fab 和 F (ab’)2 段结合。 但是，其工业化程度低于 Protein A。

Protein L结合抗体的轻链可变区，适合抗体片段的纯化。同时Protein L对于某些种属亚型有结合能力，可以作为Protein A和Protein G的有效的补充。

• Nprotein A 即为天然 (Native) Protein A，来源于金黄色葡萄球菌。有5 个结合结构域可以和 IgG 的 Fc 区有强的特异性结合。
• Rprotein A Sepharose 4 FF，为重组 Protein A，去除了天然蛋白中跟抗体结合不相关的细胞壁结合结构域，分子量从 42 KD 减少到 34 KD。主要结合 Fc 区。经基因工程改造后，单点定向偶联于琼脂糖骨架上，降低空间位阻，增加了与 IgG 的结合能力，载量比 nprotein A更高 ；同时重组的配基，在发酵和纯化过程中没有使用人源的IgG，避免了人源 IgG 的污染风险。
• rmpProtein A，多位点附着的技术，保证更低的重组protein A配基的脱落。
• MabSelect 为 rProtein A 配基，使用高流速琼脂糖凝胶基架 ( 类似 Capto，但孔径更大)。
• MabSelect Xtra(rProtein A 配基)，比 MabSelect 粒径小、载量更高，孔径更大。
• MabSelect SuRe 偶联了耐碱的 SuRe 配基，耐受 0.1~0.5 M NaOH。
• MabSelect SuRe LX 相对于 MabSelect SuRe，增加了配基密度，载量提高30%。
• 2018 年上市的 MabSelect PrismA，耐受 0.5-1 M NaOH，并且配基长度、密度以及基架孔径和孔隙率等均经过优化，具有高耐碱和高载量。
• 2020 年，推出了 HiTrap/HiScreen Fibro PrismA。采用衍生的静电纺丝纤维素为基质，传质受对流流速控制，保留时间以秒而非分钟计算，在数分钟内即可完成一次实验循环。

可以将 Protein A 和 Protein G 填料进行 1 ： 1 混合，然后纯化。Cytiva 提供 Protein A 和 Protein G 预混合的重力柱 rProtein A/Protein G GraviTrap，货号 28985256。 也可以查询文献作为参考。

不同配基结合特征如下 ：

• rProtein A 和 PrismA 配基可以结合抗体 Fc 区域以及重链可变区VH3。
• Protein G 配基除了与 IgG 的 Fc 区域特异性结合，还可以和某些抗体的 Fab 段结合。
• Protein L 配基对于人 kappa I, III 和 IV 亚型以及小鼠的 K1 轻链有很强的亲合力，结合位点在 Kappa 轻链的可变区。
• KappaSelect 层析介质与人 KappaFab ( 恒定区 ) 结合，以及LambdaFabSelect 层析介质与人 LambdaFab( 恒定区 ) 结合。

PrismA 填料，配基是改造的耐碱配基 PrismA，保留了与VH3 的结合能力，可以用于 VHH 的亲和捕获。耐 1M NaOH 和高载量，为首选。

• rProtein A 的配基填料，包括 MabSelect、 MabSelect Xtra 和rProtein A。

注意 ： SuRe 配基，如 MabSelect SuRe 和 MabSelect SuRe LX 不行。 SuRe 配基是一个同型四聚体配基，避免了不同配基结构域与抗体Fc 段亲和性的差异，也消除了对某些 Fab 段的亲和作用，不能用于 Fab 区样品结合。

多种方法，如下：

• 磁珠产品：Protein A(或 Protein G) Mag Sepharose Xtra，高配基密度，适合抗体小规模纯化，不建议用于 Co-IP。
• 重力柱：rProtein A 或 proteinG GraviTrap。更小体积样品，可以选择 SpinTrap 或 96 孔板形式的 MultiTrap 进行克隆筛选。
• 自行装填重力柱：购买 PD-10 空柱 (货号 17043501，总体积约 13 mL，膜孔径 20-85 um)， LabMate PD-10 Buffer Reservoir 缓冲液储槽，可额外增加 PD-10 缓冲液体积25 mL。
• HiTrap 柱子，使用 1/16" Male/Luer Female 转接头 (货号18111251)，用鲁尔注射器操作。

该产品可以注射器手动、蠕动泵操作，但是推荐搭配 AKTA层析系统使用。Fibro 优势为全自动连续运行，手动操作难以体现出这种优势。Fibro 适合实验样品数量多、通量要求高的条件，也可以搭配自动进样器如 Teledyne ™ 使用。Fibro 产品介绍，请参考 微文：未来已来！ Fibro PrismA 层析单元上市 ； Fibro PrismA 的新奇应用 - 高通量筛选及工艺开发。

腹水中经常含有高浓度的脂蛋白，这些脂蛋白和脂类物质会堵塞层析柱，最好能在纯化之前去除。方法一是在二价离子存在的情况下，硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋白，沉淀可以通过离心除去；方法二是PVP 能产生一个 pH 值依赖的沉淀效应，PVP 在 pH＝ 7.0 时能够沉淀 β- 脂蛋白和球蛋白。另外，有些客户也会使用硫酸铵沉淀法。具体操作方法请参考抗体纯化手册。

1. Protein G 或 Protein A Mag Sepharose 磁珠，通过磁力架操作，最短处理时间约 30 分钟。
2. Protein G ( 或 Protein A) HP SpinTrap，通过离心方式操作，在短时间(45 分钟)内轻松处理。
3. 购买散装填料。将 Protein A 与 Protein G 等比 ( 体积比 1:1)混合或单独使用。也可以选择 Immunoprecipitation Starter Pack，货号 17600235，含 2ml Protein G Sepharose 4 Fast Flow 抗体纯化填料和 nproteinA Sepharose 4 FF 填料。

普通的 Protein G 和 Protein A 配基，不耐碱，清洗效果差，使用次数很有限。建议反向清洗：

• 对于沉淀或变性的蛋白：用 6M 盐酸胍清洗 2 个柱体积，立即用 5 个柱体积的 pH 7-8 结合缓冲液来清洗，反向冲洗，每次清洗时间不超过 10min。
• 对于去除疏水性的物质 ( 如疏水性蛋白、脂蛋白、脂质 )：使用非离子型去污剂，如 0.1% Triton X-100， 37 度孵育 1 min。立即用至少 5 个柱体积的无菌结合缓冲液清洗 ；或者 70% 乙醇浸泡12 小时左右，然后立即用 5 个柱体积的 pH 7-8 结合缓冲液来清洗。注意 70% 乙醇处理时，粘稠故压力大，需要降低流速。