Superdex

根据应用目的的不同，凝胶过滤层析主要可以分为以下三种方法 ：

• 制备级凝胶过滤纯化 ：对于分辨率有较高的要求 ：(1) 上样体积一般在柱体积的 0.5% – 4% ；(2) 运行较低的流速 ；(3) 使用较高的柱子 ( 一般 ≥60 cm)。经过纯化后的样品将被直接置换到合适的缓冲液条件中，用于后续的实验或储存。
• 分析型凝胶过滤层析 ：对于分辨率有很高的要求，上样体积一般在柱体积的 0.3% – 0.5% ，使用柱子的高度一般为 30 cm。而在快速纯度检测和筛选实验中，常用的是 15 cm 柱高的柱子，可以在提供足够的分辨率的前提下，缩短运行时间，节省样品和缓冲液。
• 脱盐与缓冲液置换 ：与上述的精细分离不同，脱盐或缓冲液置换属于组分分离，即将大分子样品与小分子或离子进行分离的过程，因此对于分辨率的要求相对不高。上样体积可达柱体积的 30% 。

自 1959 年 Sephadex 葡聚糖凝胶被发明以来， Cytiva 的凝胶过滤层析填料经历了葡聚糖 - 琼脂糖 - 交联的葡聚糖与琼脂糖的发展路线：

• Sephadex G 系列，交联葡聚糖：由于粒径大且不均一、机械性能较差，目前一般主要用于脱盐与缓冲液置换。
• Sepharose 系列，交联琼脂糖：分离范围上限非常大，是大分子 (例如病毒颗粒、DNA 质粒等) 快速分离的常用填料。也是很多亲和、离子和疏水填料的基架。
• Sephacryl S 系列，葡聚糖交联 N, N’ －亚甲基二乙酰胺，经济，高效。分离范围很大，排阻极限甚至可以达到 10⁸ Da。
• Superose 系列，线性多聚糖填料：宽广的分离范围配合高分辨率。
• Superdex 系列，结合了 Sephadex 的高选择性和琼脂糖的高物理稳定性：是目前分辨率、选择性最高的凝胶过滤填料，并且还具有化学稳定性高、非特异性吸附低等优点，成为广受欢迎的凝胶过滤层析产品。Superdex Increase 系列预装柱则是进一步减小了填料粒径，显著提升了分辨率。

1. 根据目标蛋白的大小选择适合的分离范围。
2. 根据上样量，选择合适的柱体积的柱子类型。上样体积一般在柱体积的 0.5%-4%。
3. 根据具体需求确认柱子具体型号，一般选择高分辨率的柱子。

1. Superdex/Superose Increase 10/300 系列，柱体积 24 mL，推荐上样量 ≤500 μL。
2. HiLoad Superdex/Superose pg 系列，其中 16/600 柱型，柱体积 120 mL，推荐上样量 ≤5 mL ； 26/600 柱型，柱体积 320 mL，推荐上样量 ≤13 mL。
3. HiPrep Sephacryl S 系列， 16/60 柱型柱体积 120 mL，推荐上样量 ≤5 mL ； 26/60 柱型柱体积 320 mL，推荐上样量 ≤13 mL。
4. Superdex/Superose Increase 5/150 与 3.2/300，柱体积分别为 3mL 与 2.4 mL，推荐上样量 ≤50 μL。

两种柱型的共同点是上样量少 (4 – 50 μL)，而区别在于 ：5/150 柱型的柱高是 15 cm，可以实现快速的筛选 ； 3.2/300 柱型的柱高为 30 cm，因柱高较高，分辨率更高，适合少量样品的高分辨率分离或分析。

分子筛属于非吸附式层析，运行时只需要一种缓冲溶液，具有非常好的兼容性，基本上只需要考虑蛋白的稳定性来选择合适的缓冲液。一般在实验中会加入 150 – 300 mM 的 NaCl，以降低离子型的非特异性吸附。若有添加剂的使用，需要参考对应填料的说明书或者 Data File 中的化学试剂耐受信息，并且考虑是否需要做空白实验用于扣除添加剂本身对紫外检测的影响。另外，使用不同的溶液时 ( 例如加入了甘油等成分 )，因为溶液本身粘稠度的不同，请适当降低流速以保护柱子。

不建议。蠕动泵操作的主要问题有：

1. 流速控制不准确，会显著影响分离结果；
2. 无法检测运行时的压力，可能出现超压运行的问题。

一般使待分离样品的分子量位于线性分离范围中部。根据分子量 Marker 在三种柱子上的表现，三者常规推荐 ：蛋白分子量在 40 kDa 以下 (3 kDa 以上 ) 考虑使用 Superdex 75；40 – 400 kDa的样品考虑使用 Superdex 200；分离 400 kDa 以上样品时，建议选择 Superose 6 Increase。

不同预装柱在新柱使用时相同条件下的压力不同属于正常现象，主要还是要看使用过程中压力上升的数值。与新柱运行时的压力相比，当柱子产生的压力增加 0.2 MPa 以上时，就应该进行CIP 清洗。当压力显著增加 ( 例如增加 0.4 MPa 以上 )，柱子出现堵塞的情况时，建议可以先用胃蛋白酶进行处理 (1 mg/mL 胃蛋白酶溶解于 0.1 M 醋酸， 500 mM NaCl 中，进样后室温处理过夜或37℃处理 1 小时 )。另外，也可以对柱子上端滤膜进行超声清洗或者更换。如果堵塞严重，也可以小心地挖掉上方 2 – 3 mm 的填料。拆开柱子进行操作前，注意对胶面位置进行标识，之后将柱头恢复至相应位置。最好再进行柱效的测定。

主要可能是流速过快或者超压运行造成的。如果柱头有可调节高度的适配器，建议将柱头下降并压实胶面，对于塌陷非常多的柱子，请测定柱效后再决定是否继续使用。

1. 新柱子的结果中出现了旧柱子没有的峰 ：可能是由于新柱子的分辨率相对较高，检测到了该杂质出峰。
2. 目的样品在旧柱子上出峰晚 ：旧柱子使用一段时间后，填料上不可避免地会有一定的杂质吸附，这可能影响了目的样品在旧柱子上的出峰。
3. 目的样品在新柱子上出峰晚 ：可能由于新柱子上存在部分未饱和(saturated)的位点，通过电荷作用等吸附了目的蛋白。