常见问题

强离子交换与弱离子交换的差异在于强的为完全电离,弱的为部分电离。强的在较宽的 pH 范围内有着比较好的载量,而弱的会随 pH 的不同,结合的强度与载量有改变,所以能提供更多的选择性。一般推荐先尝试强离子交换,在选择性不好的时候可以再尝试弱离子交换。

相对来讲,填料的粒径越小则分辨率越高,一般分辨率由高到低为 :Capto HiRes(9 µm)、Source 15(15 µm)、Source 30(30 µm)、High Performance(HP,34 µm)、Capto ImpRes(40 µm)、Capto ImpAct(50 µm)、Capto(90 µm) 和 Fast Flow(FF,90 µm)。预装柱的柱效更佳。粒径越小的同时反压也越高。

阴离子交换包括:Q强阴离子,DEAE、ANX弱阴离子;

阳离子交换包括:S,SP强阳离子,CM弱阳离子;

复合模式:adhere强阴离子复合模式,MMC弱阳离子复合模式。

Capto是经过优化处理的琼脂糖基架,相比传统的Sepharose基架,其在动态载量、基架刚性上均有明显的提高;

  1. Capto系列,更高地动态载量,更短的保留时间,更高的装填高度;
  2. Capto ImpRes系列,更细的平均粒径,更低的反压,缩短样品的上样时间,优化实验进程。
  3. Capto S ImpAct,是一种为MAb精纯步骤设计的强阳离子交换填料,含有一个多聚体-脚手架配基,结合连接有功能基团的表面延伸臂,大大提高了结合载量 (> 100 mg mAb/mL 填料)。同时,50 um粒径具有高的分辨率,有效去除高负荷单克隆抗体中的杂质,包括HCP、脱落的配基、聚集体和片段、异构体等杂质。

自然界中绝大部分蛋白的 pI 在 5.8 或 9 附近,偏酸性更多。因此,针对未知样品,一般首先推荐强阴离子交换层析,如Capto Q,使用中性缓冲液 pH 7-8。如果 Q 挂不上,可以再尝试强阳离子交换 Capto S 或 SP Sepharose FF阳离子交换层析填料,选择 pH 5-6 范围。另外,可以选择样品流穿,杂质挂柱。 HiTrap Capto IEX Selection Kit( 货号28934388),含 Capto S、Capto Q离子交换层析填料、Capto DEAE、Capto adhere 以及Capto MMC 1mL 预装柱各一支,后两个为多模式填料,可用于填料筛选。

首先,离子交换本身是基于蛋白 “ 表面 ” 的电荷分布而不是净电荷,因此并不完全依赖于 pI 差异 ;其次,蛋白纯化本身是基于样品和杂质的带电荷差异,即便对于 pI 很接近的两种蛋白,pI 曲线每个点的斜率不同,也可以摸索到某个 pH 条件,让二者带电荷量差异尽可能大,且样品稳定。反过来,也可能出现 :两个蛋白,一个 pI 4,一个 pI 5,但是某pH 条件下,带电性质一样,又分不开。另外,建议优先尝试高分辨率填料(如 Capto HiRes 系列),减少上样量并且拉大洗脱梯度进行优化。

一般操作 pH 高于等电点时选择阴离子交换,反之选择阳离子交换。等电点可以通过 Expasy 软件预测,或使用等电聚焦、滴定法检测。建议进行 pH Scouting 筛选最佳分离 pH 条件,或者从偏离 pI 值 1 以上开始尝试。

为了促进样品结合且保证重复性,建议实验前,使用中性缓冲液 ( 如 20 mM Tris-HCl, pH 7.8) 平衡柱子,然后水洗,上样。

DEAE 配基为 -CH2-CH2-N+-(CH2-CH3)2,类似弱碱盐, N+ 会结合 NaOH 中的 OH-,且 OH- 很难解离。建议直接上 10 X 平衡缓冲液母液(离子强度大概 0.5 M),例如 10X PB,走 0.5-1 个柱体积即可平衡到正常 pH。

酸性多糖 ( 最常见 ) 可以通过 DEAE 或 Q 阴离子交换填料进行分离,碱性多糖可以通过 SP 或 CM 阳离子交换分离。在已有的文献中,经常报道使用 DEAE 进行羧基化多糖纯化,使用 Q 填料纯化硫酸化多糖和磷酸化多糖。洗脱一般通过改变 pH 或盐梯度进行。

经典多糖 2 步纯化:第一步阴离子交换 DEAE Sepharose FF 或Capto DEAE,第二步分子筛 Sephacryl S 系列,或更高分辨率的 Sepharose 系列和 Superose 6 increase,选择时注意参考分子筛填料对于线性多糖而不是球蛋白的分离范围,具体参考 SEC Selection Guide18112419 AJ。

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