手动纯化

首先，填料的使用次数依据不同的目的和条件而有差异，即便是同种填料，寿命也会不同。其次，层析柱的使用寿命受到多种因素影响，包括样品类型、层析介质所在工艺中纯化步骤 ( 捕获阶段寿命短 ) 、层析介质的类型、层析柱的维护、整个层析系统的组成、层析柱的装柱质量和试剂等的质量。如果是用于药品生产目的，一定要规定好寿命，并且经过验证，以支持产品质量是稳定的。

可能原因 ：缓冲液或样品未进行过滤、蛋白沉淀或杂质残留、清洗不及时等引起层析柱滤膜堵塞 ；流速过快、流动相粘度 ( 如乙醇等 ) 过高、温度过低。

建议处理方法 ：首先将柱子卸下来，确定是系统还是柱子堵了。如果是柱子堵了 ：参考说明书 CIP 操作进行清洁 ；更换层析柱顶端滤膜或超声清洗 (Hitrap，HiPrep 与 Precision Columns 3.2/300 柱型均不能拆卸换膜 ) ；必要时移除层析柱顶端 2-3mm 凝胶，调节 Adaptor消除顶端死体积。部分预装柱，也可以将填料倒出，去除板结或碎填料后，重新装填。测定柱效或重复之前做过的样品。后续注意样品前处理 ( 如核酸的去除、样品缓冲液条件 ) 以及层析柱的日常维护。

一般再生是每个 Cycle 都必须做的，而 CIP 可以在需要消除交叉污染或经过 1-10 个循环后做，消毒一般在更加严格的 GMP 环境中被要求降低生物负荷。特别需要注意，一定用最严格的条件进行这三个步骤，否则填料的功能会较快失去。NaOH 一直被认为能有效去除蛋白和核酸，同时还能灭活大多数的病毒、细菌、酵母、真菌以及内毒素，由于可以同时达到 CIP 和消毒的目的，因此目前的层析系统、柱子和填料一般都设计为耐受高浓度的NaOH。用于清洁的试剂 ( 如 NaOH ) ，在配制好后必须用 0.45 um的膜过滤，否者会对柱子造成二次污染。具体操作参考说明书。对于 CIP 是否足够达到清洁和避免交叉污染的目的，可以通过空白实验 Blank run 检测。另外， Cytiva 预消毒的 Ready To Process 色谱柱，无需 CIP 即可使用，节省了准备时间，加快了工艺流程。

参考如下 ：

• 延长超声时间以降低粘度。也可以使用核酸酶如 Benzonase 同时消化 DNA 和 RNA。如果来源是大肠杆菌裂解液，含有大量的DNA，可以用链霉素沉淀等方法，预先去除大量的 DNA。
• 通过层析方法去除 ：由于核酸带负电，在阴离子柱上会结合或阳离子柱上流穿，也可以有效去除核酸。
• 去除填料上结合的核酸 ： 一般采用 1M NaOH + 1M NaCl 对核酸的去除效果较好。如果核酸的吸附过强，会采用强烈的方法，3M NaCl可去除靠静电吸附的核酸，然后用 1M NaOH分解核酸，之后再用 3M NaCl 清洗。

可能的原因 ：环境温度变化 ；缓冲液未经过脱气 ；层析柱连接系统或操作不当。 建议处理方法 ：用大量脱气去离子水或 20% 乙醇反向高速冲洗层析柱，直到小气泡被带出 ( 冲洗过程建议在系统连接反压阀之后进行） 。如果大量进气，建议重新装柱。

蛋白样品最大吸收值一般在 280 nm，核酸或病毒在 254 nm或 260 nm ；多肽 215 nm ；多糖 206 nm。

1 ml/min = 在 HiTrap 1 ml 柱子上近似 30 滴 /min ； 5 ml/min =在 HiTrap 5 ml 柱子上近似 120 滴 /min。

色素性质较复杂，可以根据填料的耐受情况，尝试使用高盐、NaOH、有机溶剂（如 30% 异丙醇或乙醇）或酸（如 0.01 M HCl）处理，最好将填料拆出，分别浸泡在不同试剂中。

也可以考虑使用混合试剂进行处理，例如：通过混合8M尿素 + 0.5 M 乙酸 + 2 M NaCl，对于和阴离子交换等介质紧密结合的化合物，通常很有效；或者1 M NaOH混合1-2 M 盐；可以耐受有机溶剂的情况下，尝试1 M NaOH混合20-30%的异丙醇；根据色素的不同性质，也可以尝试不同的去污剂，注意避免操作中产生气泡。 如果去除不掉，可以定期把色素污染部分的填料去除，或验证是否对于样品纯化造成影响。

大部分填料可以在 4-40℃ 储存，或参考说明书。不可以冷冻，注意北方的冬天有时候室温低于零度，运输和储存应避免冻住。储存过程中，注意避免填料干掉，或低温产生气泡。储存液 ：对于耐碱的层析介质，可以使用 0.01M NaOH 作为储存液 ；对于不耐碱比如亲和介质，一般是用 20% 的乙醇或 2% 苯甲醇作为储存试剂。具体请参考 Application note 18-1124-57 AI。填料在进行储存的过程中，需要注意污染的问题，因此建议定期更换储存液，在 GMP 环境下，储存条件必须经过验证，以证明可以有效防止生物污染。

1. Fronting Peaks 为色谱峰前倾，表示柱子可能装的太紧，建议降低流速 ；样品超载，建议降低上样量 ；填料中形成一条通路(Channeling) 造成部分样品的路径缩短 ；柱子存在污染。
2. Tailing peaks 为色谱峰拖尾，表示柱子可能装的太松，建议使用更高流速 ；由于上样 buffer 条件不合适，造成样品没有和填料结合，建议调节上样 buffer 中的 pH 和盐浓度 ；样品太粘稠，可以稀释或更换 Buffer 体系 ；柱子存在污染 ；系统体积大造成峰变宽，检查系统模块、管线和接头。

当比较不同大小柱子的结果时，流速表示为线性流速 (cm/h)比较方便。然而，流速经常测量为体积流速 (ml/min)。为了在线性流速和体积流速之间进行转换，可以使用下面的公式。体积流速 (ml/min)= 线性流速 (cm/h)/60* 柱子横截面积 ( 平方厘米 )。也可以使用在线计算工具 Flow Rate Converter

FF装填的是基架为Fast Flow系列填料，平均粒径为90μm；HP装填的是基架为High Performance系列填料，平均粒径为34μm。在纯化过程中，粒径小的填料，能提供更高的分辨率，峰展宽也更窄，但会带来更高的反压，因此流速更慢，而粒径大的填料反之。

1. 无论哪一种纯化方式，我们都需要保证样品可溶无颗粒，因此上样前需要通过离心或者过滤处理，在必要的情况下，需要对样品的稳定性进行测试，以避免纯化过程中发生样品的降解、聚集、变性。
2. 在分子筛实验过程中，上样量有严格要求，具体请参考对应柱子的说明书，有推荐最大上样体积，而对于样品的浓度，在高分辨分离时建议不超过10mg/ml的浓度，另外可以通过核酸酶处理降低样品中核酸含量以降低样品的粘度；
3. 在其它结合模式纯化（离子交换、AC、HIC等）过程中，我们需要根据载量确定填料用量，而上样体积不是限制因素（因为结合为动态平衡，所以样品浓度对结合效率有一定影响，所以当样品浓度非常低的时候会考虑浓缩后上样）；
4. 样品的上样条件需要与所选择的纯化方式相匹配，如pH和离子强度。必要时可通过脱盐或者膜过滤等方式对样品的缓冲液条件进行优化；

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柱效测定的具体方法，请参考填料和预装柱的使用说明书上的标准流程。如没有，可以参考如下方法：

丙酮测试：对凝胶层析柱，亲和层析柱和离子交换柱来说，以1%丙酮作为样品，以水为流动相测定280 nm的紫外吸收值。对疏水层析柱和反向层析柱来说，以1%丙酮溶于20%乙醇溶液作为样品，以20%乙醇为流动相测定280 nm的紫外吸收值。

氯化钠测试：以0.8 M NaCl作为样品，以0.4 M NaCl为流动相测定电导值。两种方法的上样量均为1% CV，使用30 cm/h的流速。

1. 1. 将需要测试的层析柱连接到ÄKTA系统上，打开Method Editor窗口，点击File→New method→ Column Performance Test →OK；
   

   

   图 1 建立柱效测定方法

2. 2. 根据所用的预装柱或空柱和填料的类型，来设定压力报警，柱体积，柱位，缓冲液入口，流速（测柱效全程使用30 cm/h 线性流速），平衡时间（至少 1.5 CV），上样体积（1% CV）等信息。随后点击File→Save As来保存该柱效测定方法；
   

   

   图 2 设定柱效测定方法参数

3. 3. 随后将 1% CV 的样品（ NaCl或丙酮）注入层析柱，然后自动运行已保存好的测柱效方法；
4. 4. 测定结束后在Evaluation窗口打开结果进行柱效分析，在 Curve 窗格中点击右键，选择Customize，去掉不需要显示的曲线；
   

   

   图 3 勾选柱效测定曲线

5. 5. 点击Integrate→Peak Intergrate 进行积分处理，在弹出的Peak Intergrate窗口选择需要积分的曲线以及积分表存储位置，基线类型默认为 Calculate baseline；
   

   

   图 4 峰积分设置

6. 6. 在积分窗口中选择Peak Window，出现以下窗口，通过拖动左右两条直线可以选择需要进行积分的范围，点击OK确认；
   

   

   图 5 峰积分窗口设置

7. 7. 在积分窗口点击 Reject Peaks 对需要分析的色谱峰可进行高级定义，包括最小峰高、峰宽、峰面积、峰个数等，在这里最常用的是在 Peak area is less than 输入需要显示的最大峰的个数，点击 OK 确定；
   

   

   图 6 峰定义设置

8. 8. 在 Column height (bed height) 一栏中输入柱床高度， 在柱效测定中此项必须填写。随后点击OK，查看积分结果；
   

   

   图 7 峰积分设置

9. 9. 在 Peak data 区域点击右键，选择 Customize→ Select peak table columns 对话框中找到需要显示的数据如Plate height（HETP）、 Asymmetry 等，点击 OK 执行，Peak data区域中将会显示增选的分析结果。判断层析柱柱效是否合格的标准是Plates per meter 和 Asymmetry。 Plates per meter要求大于说明书上要求的最低限（如 >3000 或 20000 ），Asymmetry 要求处于 0.8-1.8之间 (图9仅作示例)，满足这两点说明层析柱装填没有问题。
   

   

   图 8 峰积分数据显示

   

   图 9 峰积分数据显示

柱效测定文件：Column efficiency testing-pdf (cytivalifesciences.com.cn)