常见问题
- 捕获质粒DNA,去除RNA杂质。使用Sepharose 6 Fast Flow进行第一步纯化,它可根据分子大小的不同,对不同的组群进行分离,即分子筛原理。质粒DNA和RNA的分子量差异很大,因此上样量可以达到0.3CV。在纯化时,可同步进行缓冲液置换,直接与第二步亲和层析纯化进行无缝对接。
- 去除开环质粒DNA。使用Capto PlasmidSelect进行第二步纯化,它可以特异性将开环的质粒DNA (ocDNA)和超螺旋的质粒DNA (scDNA)分开。与传统的PlasmidSelect Xtra相比,Capto PlasmidSelect可以在更高的流速条件下获得更高的载量,其DBC可以达到3 mg/mL,经过二步纯化后,超螺旋质粒DNA的纯度可以提高到95%以上。
- 去除痕量杂质及内毒素。经过前两步层析纯化之后,质粒的纯度和均一性已经满足了生产需求,但依然存在内毒素的隐患,最后一步层析的重点即是去除内毒素和痕量杂质。使用高分辨率阴离子SOURCE 30Q或者Q ImPres进行精纯后,内毒素含量可降至<1 EU/mg。