作者：Sai Pooja Mahajan et al.
发表日期：2018年12月
发表期刊：Scientific Reports
研究背景
α-突触核蛋白 (α-syn) 是一种突触前神经元蛋白，在病理学上与许多统称为突触核蛋白病的神经退行性疾病相关，包括帕金森病 (PD)、路易体痴呆 (DLB) 和多系统萎缩 (MSA)。由于 α-syn 可能在发病机制中发挥核心作用，因此降低细胞内水平以防止易损细胞中的异常错误折叠、聚集和毒性可作为减缓 PD 和其他突触核蛋白病进展的潜在治疗策略。为了验证此种猜想，提出细胞内抗体 (intrabody)作为靶向和/或中和不同异常 α-syn 物种的策略。Intrabody 是经过工程改造的抗体片段，可在细胞内表达，并与同源靶抗原结合。研究发现单链 Fv (scFv) 体内 NAC32 对 α-syn 的氨基酸 53-87 具有特异性，被发现可降低由 A53T 突变体引起的毒性。
不幸的是，分离在活细胞中表达时表现出足够稳定性和结合亲和力的内体仍然是一项重大挑战，特别是在细胞质的还原环境中。研究人员打算采用定向进化策略来增强 NAC32 的亲和力本文描述了一种 VHNAC1 计算亲和力筛选的策略，VHNAC1 是一种对 α-syn 的 NAC 结构域特异的重组单结构域骆驼抗体 (VHH)。使用先进的分子动力学 (MD) 方法，建模结果表明单点突变 (N77D) 足以将 VHNAC1 的亲和力提高一个数量级以上，由此产生的 N77D 突变体表现出高纳摩尔结合亲和力，由表面等离子体共振 (SPR) 实验所证实 。
实验方法
使用重力柱通过 Ni-NTA 色谱法从可溶性全细胞裂解物中纯化Intrabody。可溶性裂解物在旋转平台上与 Ni-NTA 树脂在 4°C 下孵育 1h。将含有填料的裂解物倒入柱中，直到所有的裂解物和树脂流入柱中。将流出物再次倾倒在树脂上再次流出。用含有 20mM NaH2PO4、300mM NaCl 和 90 mM 咪唑 (pH 7.5) 的缓冲液洗涤柱子四次。使用含有 20mM NaH2PO4、300mM NaCl 和 250mM 咪唑 (pH 7.5) 的缓冲液洗脱蛋白质。
亲和纯化洗脱的蛋白质浓缩后进行尺寸排阻色谱 (SEC)。将 2.5mL浓缩蛋白质 (一次 1mL) 注入连接到 FPLC 系统的 Superdex 75 柱中，样品以 0.5mL/min 的流速在 4 °C 在含有 15mM Tris-HCl、500mM NaCl 的缓冲液中。高盐浓度用于防止聚集。通过 280nm 处的吸光度监测体内的迁移，并收集 250μL 级分。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 17524802 | HisTrap HP | 5 × 5 mL |
| 预装柱 | 29148721 | Superdex 75 increase 10/300 GL | 1 × 24 mL |
| 填料 | 17526801 | Ni Sepahrose HP | 25 mL |
| 空柱 | 28988937 | Column XK 16/20 | 16/ 20 |
