作者：Makoto Mizukami et al.
发表日期：2018年6月
发表期刊：Protein Expression and Purification
研究背景
革兰氏阳性菌Brevibacillus choshinensis特别适用于分泌蛋白的表达。利用B. choshinensis系统分泌表达曲妥珠单抗Fab抗体片段分别构建了含有His-tag的重组曲妥珠单抗Fab (His-BcFab) 和不含His-tag的Fab (BcFab)。His-BcFab和BcFab经过常规柱色谱的组合纯化后其收率在10-13％范围。经表面等离子共振等技术证明BcFab具有正确的空间结构和结合功能。
实验方法
不带His-tag的抗体片段纯化：85 mL上清经pH 6.0、25 mM NaPB透析换液后采用SP 5 mL HiTrap柱 进行初步纯化，500 mM线性梯度洗脱，样品在0.13-0.16 M NaCl条件下被洗脱，合并洗脱组分用pH6.9、5mM NaPB将收集的样品 (约0.7 mg) 稀释十倍，然后进样到羟基磷灰石柱上，采用200 mM的NaPB线性洗脱实现中纯，再次合并洗脱样品 (约0.14 mg) 后用5 ml Hitrap 柱进行换液 (25 mM NaPB, pH 6.0)，最后经Resource S精纯，合并NaCl浓度从0.10到0.11 M洗脱的目标组分进行后续实验。
带His-tag的抗体片段纯化：采用pH 7.4、50 mM NaPB (0.15M NaCl) 的缓冲液等体积 (42 mL) 稀释pBIC-His-BcFab转化细胞的分批补料培养收获上清液。将稀释后的上清进样到1 mL的HisTrap标签亲和柱进行捕获，使用含20、50、100和200 mM咪唑的NaPB进行洗脱，合并咪唑浓度在50-100 mM的His-BcFab组分，使用pH 6.0的5 mM磷酸钠磷酸钠 (NaPB) 稀释十倍后进样到1 mL HiTrap SP色谱柱中， 用从0到1.0 M的NaCl线性梯度洗脱结合的蛋白。合并在0.18–0.24 M NaCl中被洗脱的蛋白质组分。用pH 6.0、25 mM NaPB，透析后的样品 (0.5 mg) 上样到1 mL Resource S柱，并用从0到0.5 M NaCl线性梯度洗脱结合的蛋白。合并在0.16-0.17 M NaCl中被洗脱的His-BcFab组分，进行后续的鉴定实验。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 17524802 | HisTrap HP | 5 × 5 mL |
| 预装柱 | 17515701 | HiTrap SP FF | 5 × 5 mL |
| 预装柱 | 17117801 | Resource S | 1 x 1 mL |
| 填料 | 17526801 | Ni Sepahrose HP | 25 mL |
| 空柱 | 28988937 | Column XK 16/20 | 16/ 20 |
