作者：Hu Y et al.
发表日期：2021年10月
发表期刊：Foods

研究背景

羽扇豆与花生、大豆、豌豆等同属于豆科植物。白羽扇豆是应用最广泛的品种，其蛋白质含量占其干重约三分之一，经常作为牛奶和大豆的常见替代品。在纯素肉流行后，羽扇豆提取物被越来越多用于提高食物的蛋白质含量和膳食纤维。但羽扇豆会导致一些敏感人群产生过敏反应，个别严重甚至发生致命反应。Lup an 1过敏原已被确定为会引发过敏的主要过敏原，由于还未有针对羽扇豆过敏的具体治疗策略，故需要对羽扇豆过敏患者预防性治疗，包括排除性饮食。食物中羽扇豆过敏原检测的方法的建立是必要的。目前的检测方法可以通过不同的生物标志物，例如DNA、蛋白质、低聚物分析、免疫分析等。其中免疫分析法检测抗原，可以提供食物样品中微量过敏原污染的直接信息，故免疫分析已被广泛用于过敏原检测，但食物加工后表位变化，过敏原特异性单抗、多抗的制备及质量使得免疫测定复杂化。需要引入新的候选抗体，提高羽扇豆过敏原检测特异性和准确性。

本文选择由骆驼科物种产生的仅包含一个重链可变区的功能性抗体的纳米抗体Nb进行后续研究。Nb的特性决定其具有较高的亲和力和特异性，有助于识别其靶抗原，可能识别出传统抗体难以靶向的独特抗原表位。且Nb还能在高温、极端pH、变性剂存在下保持溶解度和稳定性，使其成为免疫测定中非常合适的候选分子。

实验方法

将羽扇豆粗提物抗原注射到羊驼体内进行六周免疫接种。取羊驼颈静脉抗凝血50ml，获得外周血单核细胞，以制备总RNA，PCR扩增VHH编码基因片段，插入噬菌体载体内，转化感受态细胞，利用特异性抗原对噬菌体进行富集。诱导产生带有His标签和血凝素（HA）标记的Nbs产生，并对其进行测序。将含有Nb基因的pMECS噬菌体转入大肠杆菌WK6细胞中进行生产。收集细胞，渗透休克细胞释放Nbs。

使用两步亲和对Nbs进行纯化，第一步使用Ni-NTA亲和对Nbs进行粗纯，使用含有0.5 M咪唑的PBS缓冲液将His-Nbs洗脱下来，收集的组分加载到HiLoad 16/600 Superdex 75 pg凝胶过滤层析柱中进行精纯。最后得到1 mg/mL的His-Nbs，熔化温度在52-77℃之间，可用于免疫分析法的开发。

产品信息

Reference
Hu, Y.; Zhang, C.; Yang, F.; Lin, J.; Wang, Y.; Wu, S.; Sun, Y.; Zhang, B.; Lv, H.; Ji, X.; et al. Selection of Specific Nanobodies against Lupine Allergen Lup an 1 for Immunoassay Development. Foods 2021, 10, 2428. https://doi.org/ 10.3390/foods10102428