作者：Walls A C et al.
发表日期：2020年11月
发表期刊：Cell
研究背景
2019年冠状病毒疾病 (COVID-19) 爆发，成为全球大流行疾病。2020年1月，快速病毒分离和测序表明，新出现的人畜共患病病原体是一种与SARS-CoV密切相关的冠状病毒，因此被命名为SARS-CoV-2。由于这一场公共卫生事件，截至于2020年10月，WHO统计全球有超过3400万感染以及超过100万死亡病例。急切需要一种安全、有效和可扩展的疫苗来阻止正在发生的SARS-CoV-2大流行。
与其它冠状病毒相似，SARS-CoV-2是通过病毒表面形成的突出的三聚体——跨膜刺突糖蛋白 (S蛋白) 介导进入宿主细胞，故S蛋白作为感染中和抗体Abs的主要靶点和疫苗设计重点。
现有的基于结构的自组装蛋白纳米颗粒免疫原设计，在小鼠体内引发对SARS-CoV-2的有效和保护性抗体反应，纳米抗体疫苗属于重组蛋白抗原的亚单位疫苗，免疫原性低，是一种经过临床验证的疫苗模式。结果表明纳米颗粒疫苗诱导的抗体可以识别多个不同的受体结合域 (RBD) 表位，表明其可能不容易逃脱突变。结果同时强调了强大的抗原展示平台的实用性，后续研究可在同一纳米颗粒上共同展示多种抗原，可以提高疫苗诱导免疫反应的广度，以用于预防下一次的冠状病毒大流行。
实验方法
构建表达人源ACE2-Fc的质粒，并通过E.coli生产，将得到的质粒转染到Expi293F细胞中诱导表达单抗hACE2-Fc片段。收获培养上清液，使用MabSelect PrismA亲和进行纯化。洗杂步骤分别使用5CV的pH 7.2，20 mM NaPO4，150 mM NaCl缓冲液以及pH 7.2，20 mM NaPO4，1 M NaCl缓冲液，洗脱步骤使用3CV的pH 3.0，100 mM甘氨酸缓冲液，洗脱的组分使用2 M Tris-base 中和至50 mM终浓度。纯化的ACE2-Fc使用凝血酶蛋白酶进行消化后，经过HiScreen MabSelect SuRe亲和，去除可以结合的hACE2-Fc及Fc片段，得到hACE2，经过0.22 μm滤膜灭菌备用。
CR3022蛋白通过上述方法，同样去掉CR3022 IgG蛋白的IgG部分，并通过HiScreen MabSelect SuRe亲和纯化得到流穿的CR3022组分，经过0.22 μm滤膜灭菌备用。
重组S309蛋白以Fab片段形式通过质粒瞬时共转染到expiCHO细胞中表达重链和轻链。蛋白通过HiTrap MabSelect Xtra进行纯化，后接一步脱盐柱，将其置换到pH 7.2，20mM NaPO4，150 mM NaCl缓冲液中，得到的抗体片段使用0.22 μm滤膜进行除菌，并放于4℃保存备用。
构建工程菌株E.coli以及expi293F细胞，诱导表达RBD-I53-50A和RBD-I53-50B.4PT1蛋白，使用Ni Sepharose 6FF亲和进行样品的捕获，洗脱的样品浓缩后接一步Superdex 200 Increase 10/300或HiLoad Superdex 200 pg凝胶精纯去除杂蛋白。亲和步骤使用pH 8.0，50 mM Tris，500 mM NaCl，0.75% CHAPS缓冲液，洗脱过程咪唑梯度从30 mM到500 mM。凝胶过滤使用pH 8.0，50 mM Tris，500 mM NaCl，0.75% CHAPS缓冲液。
体外组装三聚体蛋白I53-50A和五聚体蛋白I53-50B蛋白，合成由120个亚基组成的复合物I53-50纳米粒子。组装后的纳米粒子使用不同的凝胶柱完成不同的功能。使用Superose 6 Increase 10/300凝胶过滤用于分析纳米颗粒的尺寸，Superdex 200 Increase 10/300凝胶过滤用于小规模中试组装后去除未组装组分，HiLoad Superdex 200 pg用于纳米颗粒生产后去除未组装部分。
hACE2和CR3022蛋白用于表征两个S-蛋白特异性单抗与I53-50A的RBD融合时的抗原性及组装的纳米颗粒免疫原中多个RBD表位的可达性。实验结果显示，所有的RBD纳米颗粒都能很好地与固定化的ACE2-Fc、CR3022及S309蛋白结合，证明，多价的双组分纳米颗粒可引起多种多克隆抗体反应，可针对多个不同的标为，将可能发生的逃逸突变风险降到最低。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 11003495 | HiTrap MabSelect SuRe | 5 × 5 mL |
| 预装柱 | 28408261 | HiTrap MabSelect Xtra | 5 × 5 mL |
| 预装柱 | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL | 1 × 24 mL |
| 预装柱 | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL | 1 × 24 mL |
| 预装柱 | 28989336 | HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | 1 × 320 mL |
| 预装柱 | 17525501 | HisTrap FF | 5 × 5 mL |
| 填料 | 17549801 | MabSelect PrismA | 25 mL |
| 填料 | 17531801 | Ni Sepharose 6 FF | 25 mL |
| 填料 | 17371201 | Ni Sepharose excel | 25 mL |
| 空柱 | 28964441 | HiScale 16/20 | 16/20 |
