作者：Smith R H et al.
发表日期：2009年11月
发表期刊：Molecular Therapy

研究背景

随着rAAV介导的基因治疗接近临床，规模化生产rAAV受到了很多关注。特别是，通过使用重组杆状病毒技术在昆虫细胞中生产rAAV载体已被证明是一种高效的可放大生产rAAV的手段。此文描述一种使用简化的杆状病毒-AAV表达载体系统，在昆虫细胞中生产rAAV-1和rAAV-2的方法，使用一步亲和即可得到均一的纯化的rAAV颗粒。

实验方法

构建Bac-RepCap杆状病毒-AAV构建体，感染昆虫Sf9细胞，使AAV可在Sf9细胞中进行生产。收集感染后的昆虫Sf9细胞提取物，用核酸酶处理以消化未包壳的DNA后，备用。

将上述样品装载到装有AVB Sepharose High Performance亲和填料的Tricorn 10/100的空柱中，使用pH 7.4的PBS缓冲液进行洗杂，结合分离目标样品使用低pH (pH 2.7) 的甘氨酸-盐酸缓冲液进行洗脱，设置每管1 ml的组分收集，预先在收集管中放置有100 μL的1 M pH 8.0 Tris-HCl缓冲液进行中和。

将洗脱的样品组分进行SDS-PAGE和银染分析，SDS-PAGE图显示出三条蛋白条带，分别对应AAV的三个特征衣壳蛋白VP-1、VP-2、VP-3 (分子量分别为81.4、66.2和59.6 KD)，同时抗AAV以可血清对跑胶条带进行WB分析，也同样证实了三个条带确为AAV三个特征衣壳蛋白，银染结果表明纯度＞90%，透射电镜观察结果显示出密集的无包膜二十面体颗粒，直径为20-25 nm，是胞病毒科的特征。

产品信息

Reference
Smith R H , Levy J R , Kotin R M . A Simplified Baculovirus-AAV Expression Vector System Coupled With One-step Affinity Purification Yields High-titer rAAV Stocks From Insect Cells[J]. Molecular Therapy, 2009, 17(11):1888-1896.