作者：Qiang, Wang et al.
发表日期：2015年11月
发表期刊：Molecular Therapy- Method & Clinical Developemnt
研究背景
随着越来越多以AAV载体为基础的治疗候选药物、具有多向性的新型AAV的发现及其在临床试验中应用的日益增加，迫切需要大规模GMP级的AAV载体生产工艺，以生产纯化多种血清型的AAV。人们探索多种纯化AAV载体的方法，主要包括有基于氯化铯和碘沙醇梯度的浮力密度离心，以及基于层析的技术，例如体积排阻、离子交换和亲和层析及其组合。
其中AVB填料可用于捕获AAV1、AAV2、AAV3和AAV5，例如从杆状病毒-昆虫细胞的细胞裂解液中纯化AAV1。尽管AVB填料可以纯化上述AAV血清型，但对它们的亲和力是有所不同的，文章通过序列对比、结构分析和与AVB填料的结合实验成功鉴定了AVB填料与AAV的特征性结合表位，该表位的存在和缺失解释了不同血清型与AVB结合的差异。
结合表位的鉴定可避免在后续实验中需要重新选用其他血清型AAV的情况下，更换纯化方案的风险。对于与AVB填料结合性较差的AAV血清型，更换表位可能是一种可行的解决方案，使得多种血清型的通用纯化工艺的建立成为可能。
实验方法
构建pAAV2/8, pAAV2/rh.64R1, pAAV2/9和pAAV2/3B表达质粒。使用定点诱变试剂盒对这些质粒进行诱变。当HEK293细胞生长85%时，用聚乙烯亚胺通过三重质粒鸡尾酒法转染到细胞中。转染5天后，收集细胞培养上清液，用核酸酶进行消化。使用切向流过滤，浓缩经0.5 M NaCl处理的上清液，使用碘二醇梯度密度离心后，通过超滤管将样品置换到含有0.35 mM NaCl的DPBS缓冲液中，加入5%甘油，-80℃保存备用。对于需要纯化的样品，在切向流过滤步骤，直接使用AVB.A Buffer (pH 7.5的20mM Tris，0.4 M NaCl缓冲液) 进行缓冲液置换，样品保存在4℃，使用前使用0.22 µm滤膜进行过滤。
将不同血清型AAV载体分别加载到HiTrap AVB Sepharose High Performance 1 mL预装柱中，使用6 CV的AVB.A Buffer (pH 7.5的20 mM Tris，0.4 M NaCl缓冲液) 进行平衡，再使用3 CV的AVB.C Buffer (pH 7.5的20 mM Tris，1 M NaCl缓冲液) 进行洗杂，最后使用3 CV的AVB.B Buffer (pH 2.5的20 mM 柠檬酸钠，0.4 M NaCl缓冲液) 进行洗脱，洗脱收集管中预放有1/10体积的BTP Buffer (pH 10.0，0.2 M Bis-Tris-propane缓冲液) 进行中和，整个纯化过成使用0.7 ml/min流速进行。
纯化结果分析显示，rh.10、hu.37、rh.64R1、AAV8、AAV3B这几种血清型AAV中，rh.64R1、AAV8在AVB上的结合相对较弱，rh.10、hu.37在AVB上的结合相对较好，在AAV3B上最好。在经过序列替换，改造了rh.64R1、AAV8、AAV9中VP1中665-670号序列，替换成AAV3B对应序列表位，诱变后的AAV明显对AVB填料的亲和性变强，同时，也做了反向对比，将AAV3B 665-670号序列替换成了AAV9对应序列表位，发现亲和性有一定程度降低，说明665-670号位置序列不同影响不同血清型AAV对AVB填料的亲和性。
后续将AAV野生型和突变型在Huh7细胞中进行转导分析，结果显示，将原来对AVB亲和性差的AAV血清型的表位替换后，不仅不影响其在细胞中的转导 (传染性)，同时还可以增加其对AVB填料的亲和性。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 28411211 | HiTrap AVB Sepharoose HP | 5×1 mL |
