作者：Eglon MN, et al.
发表日期：2009年11月
发表期刊：Journal of Gene Medicine

研究背景

前期已经有文献描述了在贴壁和悬浮细胞中生产腺病毒载体，例如HEK-293或PER-C6细胞，培养规模达到每批次100 L。文献已经描述了各种培养条件，包括滚瓶，中空纤维技术和涉及灌注和分批填喂方法的生物反应器。用于研究和临床前应用的病毒载体的纯化主要使用氯化铯密度梯度和过夜超速离心进行，尽管许多市售试剂盒现在能提供具有相当滴度水平的的快速纯化。然而，这些过程仅限于实验室规模的制备。

纯化适合临床应用规模载体仍然是一个必须应对的挑战，这促进腺病毒介导的基因治疗从工作台迁移到临床。这样的过程必须在经济上可行，并且应该包含强大的质量控制测试计划，以确保产品的一致有效生成，同时最大限度地减少通常由外来细胞蛋白和残留病毒成分 (例如六邻体单体) 的存在引起的免疫并发症。

层析技术作为载体纯化的核心技术有明显的趋势。已有学者应用了几种方法，包括阴离子交换 (AIEX)，凝胶过滤 (GF)，疏水相互作用和固定化金属亲和色谱。与使用CsCl的传统工艺不同，层析提供了一种直接的线性放大路径，并且已经报道了较为成熟的纯化程序。

实验方法

接种并传代培养HEK-293细胞，当汇合度为70%-90%时，转染表达GFP的AdV-GFP。转染2-4 h后，添加100 mL培养基，37℃培养48-72 h。4℃，3000 g，离心10 min收集沉淀，并利用13.5 mL 50 mM Tris，2 mM MgCl2，5% glycerol (v/v) pH 8.0悬浮。干冰/乙醇冻存，37℃复溶，反复冻溶三次，裂解细胞。4℃，3000 g，离心10 min，收集裂解后产物，将1200 U核酸酶添加到12.5 mL的裂解液中，37℃孵育1 h，涡旋处理降解核酸。2–8 ℃，3000 g离心10 min收集上清，0.8 μm过滤器过滤上清。

利用50 mM Tris，2 mM MgCl2，0.4 M NaCl，5% 甘油 (v/v)，pH 8.0缓冲液，300 cm/h流速平衡Q Sepharose XL。在同样的缓冲环境中，以100 cm/h流速泵入5 mL澄清后样品。待电导稳定不变时，向系统中添加50 mM Tris，2 mM MgCl2，0.6 M NaCl，5% 甘油 (v/v)，pH 8.0缓冲液进行一步洗脱，完成Ads-GFP的捕获。

利用Sepharose 4 FF将捕获的含有Ads-GFP的组分进行精纯。将50 mM Tris，2 mM MgCl2，0.4 M NaCl，5% 甘油 (v/v) 泵入系统中，以150 cm/h流速对层析柱进行平衡。待电导稳定不变时，进行60 cm/h的进样及洗脱，获得目标组分。

SDS-PAGE显示层析获得组分纯度可以和CsCl提取结果相比。噬斑实验验证层析后产品的产率为40%，与CsCl纯化产率无显著性差异。Benzonase ELISA Kit II定量终产品中核酸酶的含量，结果显示AIEX纯化导致核酸酶去除率高达98%，SEC纯化Ads核酸酶去除率高达97%。改变层析顺序时，纯度及核酸酶去除效果均不能达到最佳。

产品信息

Reference
Eglon MN, et al. Purification of adenoviral vectors by combined anion exchange and gel filtration chromatography. J Gene Med. 2009 Nov;11(11):978-89.