作者：Adriana Mota-Cobián et al.
发表日期：2020年4月
发表期刊：Nanotechnology
研究背景
包裹磁性纳米粒子的脂质体，称为磁脂质体 (MLs)，已成为生物药物研究的热门，主要应用于远程触发的药物输送和诊断成像。 磁脂质体制备中最关键的步骤之一是游离磁性纳米粒子 (MNPs) 的去除，因为纯化效果不好会产生误导性结果。尤其当磁脂质体被装载入脂质体腔时，纯化更具挑战，由于含磁性纳米粒子的磁脂质体和空的脂质体 (ULs) 之间分子量差异非常小。
本研究使用五种商业化的具有不同构型的磁性纳米粒子，对三种众所周知的纯化技术进行了比较，即体积排阻色谱、离心法和盐诱导聚集。对其中两个磁性纳米离子最优的纯化技术进行了进一步研究。研究表明，针对不同的磁性纳米粒子，最有效的纯化技术是不同的，需要进行详细的研究以确定最优的方法。
实验方法
通过比较游离的磁性纳米粒子所占的百分比和磁脂质体的收率来判断纯化方法的有效性。在纯化前后，分别测定了磁性纳米粒子和空脂质体的浓度。
- 离心法
离心法是分离游离的磁性纳米粒子和磁脂质体的最常用方法。因为离心力和转速因纳米粒子的不同而有较大差异，本研究分别做了如下条件 (1000g, 15min; 1000g, 30min; 8000g, 15min; 10000g, 15min; 13000g, 5min)。理论上认为离心之后，纳米粒子发生沉淀而脂质体依然在上清中。对离心后去除掉的纳米粒子和回收得到的磁性脂质体的比例都进行了测定，分别以离心前浓度作为参照。
结果表明，离心法对五种MNPs中的CT有较好的去除效果；该方法所得脂质体的回收率均较高，但随着离心力的增强，脂质体的回收率有所下降。 - 盐诱导的聚集
通过增加盐浓度诱导颗粒聚集，根据颗粒原料、尺寸、表面带电性的不同，聚集可能立即发生或随着时间的推移而发生。本研究中，通过加入NaCl使游离的MNPs (magnetic nanoparticles) 发生聚集。具体做法：取5 M NaCl添加至终浓度0.4 M；然后2000 g离心5 min；最后弃沉淀，测定上清中游离的纳米粒子和空脂质体的浓度。通过比较初始浓度，测得游离纳米离子的百分比和脂质体的收率。
虽然与离心法相比，盐诱导聚集法需要加一步脱盐来去除NaCl (该步骤会造成样品的稀释)，该方法仍然是三种方法中耗时最短的。除此之外，与其他纯化方法相比，在保证相似的MNPs去除效率的前提下，该方法所得的脂质体回收率相对更高，而且使用该方法可以避免离心对脂质体形态造成的损坏。 - 凝胶过滤层析法
用于分离游离的纳米粒子和磁性纳米脂质体的凝胶过滤层析介质主要有Sepharose 和Sephadex系列。本研究中，分析了三种不同排阻范围的凝胶过滤填料的分离效果：Sephadex G-25，Sepharose 4B， Sepharose 2B。Sepharose填料被装在1.5 × 13 cm的空柱中，Sephadex填料采用Miditrap预装柱。所有柱子在使用之前先用磷脂进行预饱和，以最大程度地减少脂质体的损失，随后用PBS进行平衡。取MNPs和ULs过柱，分管收集各组分。游离的MNPs和装载入脂质体的MNPs的浓度通过金属离子的含量进行测定。
结果表明，使用Sephadex G-25预装柱纯化时，所有的MNPs的洗脱曲线都完全与空壳脂质体重叠而无法分开，因为该填料的分辨率有限。用Sepharose填料进行分离时，MNPs的洗脱曲线均出现了延迟。Sephadex G-25和Sepharose 4B的分离范围不足以分离MNPs (除CMX MNPs外)。这两种层析填料可用于荧光，药物或更小的纳米颗粒的纯化。纯化结果显示，Sepharose 2B对CMX、COOH、SHP这三种MNPs的去除率均在80%以上，是进行广泛的MNPs纯化的最有效方法。
结论：
本研究对装载入脂质体腔内的MNPs的纯化方法进行了整体研究，结果证明离心法和盐诱导聚集法对五种MNPs中的一种有较好的纯化结果。凝胶过滤层析法对其中三种MNPs的纯化取得了较好的结果。具体采用哪种纯化方法，需要结合MNPs的特性进行选择。
用荧光法对制得的脂质体进行表征，将收集好的96孔板直接用于荧光表征，读取荧光值。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 28918008 | PD MidiTrap G-25 | 50 columns |
| 填料 | 17012001 | Sepharose 4B | 1 L |
| 空柱 | 28988937 | Column XK 16/20 | 16/20 |
