作者：LAURA E. EASTON et al.
发表日期：2010年3月
发表期刊：RNA
研究背景
RNA 在基因表达的转录后调节的核心作用已经明确。需了解这些 RNA 如何执行它们的生物学功能，那么结合X 射线晶体学和 NMR 光谱学的结构分析生化表征是迫在眉睫的。生化和结构研究所需的毫克量的 RNA 可以通过使用 T7 RNA 聚合酶从 DNA 模板进行体外转录而制备，但最终 RNA 产物的纯化仍然相当耗时。
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用于纯化转录 RNA 的方法。尽管该方法提供了高达 100 个核苷酸 (NT) 的分辨率，但它既耗时又使 RNA 变性，这可能导致从变性凝胶中洗脱得错误折叠或聚集 的 RNA 类型。
Batey 和 Kieft 开发的大规模亲和纯化使用串联的 MS2 外壳蛋白结合茎环作为 RNA 转录物 3’末端的亲和标签，与 Ni2+ 亲和柱基质结合，通过与六组氨酸标记的 MBP-MS2 外壳蛋白融合物相互作用。这种强大的亲和纯化方案允许生产具有均质 3’ 末端的毫克级天然 RNA，这对于晶体学应用来说是必不可少的。然而，转录过程中形成的寡聚 RNA 种类，不能通过这种技术与单体种类分离，并且需要进一步通过尺寸排阻色谱进行单体纯化。此外，超过 200nt 的 RNA 转录物包含核酶和亲和标签，这又显著降低了 RNA 产物的最终产量，这对于 NMR 光谱应用显然是不理想的。
使用高分辨率快速高效液相色谱 (FPLC) 系统基于大小排阻的纯化在非变性条件下从 RNA 产物中有效地除去未掺入的 rNTPs 、小的流产转录物和高分子量质粒 DNA 模板。尽管有这些优点，尺寸排阻色谱在其使用之前仍然需要额外的、耗时的步骤。需要多次酚/氯仿抽提以除去 T7 RNA 聚合酶以及为了达到最佳分辨率需要对转录后样品进行脱盐和浓缩处理。
本文提出了一种实验室常规使用的方法，用于快速、大规模纯化天然的、结构均一的 RNA，适用于生化和结构研究。该方法将转录反应粗产物直接进行 DEAE-Sepharose 弱阴离子交换层析，无需进一步操作。T7 RNA 聚合酶和未结合的 rNTPs 在流穿液中被发现。小流产转录物、目标 RNA 产物和质粒 DNA 模板在 DEAE 柱上通过低盐梯度洗脱分离。这种易于实施的天然 RNA 纯化方法不仅消除了对 T7 RNA 聚合酶的繁琐的酚/氯仿提取的需要，而且基于它们电荷的总体差异，可以将寡聚 RNA 种类与单体 RNA 分离。
实验方法
样品前处理：转录反应体系 (10~40 mL) 37°C 孵育 2~4 小时，加 EDTA 至终浓度为 50 mM 终止反应。添加等体积的苯酚/氯仿 3000 g 离心 10 min，并保留上清。
纯化方法：
- 柱平衡：缓冲液 A (50 mM 磷酸钠，150 mM NaCl，and 0.2 mM EDTA) 平衡 3个柱体积；
- 进样：转录反应体系无需苯酚/氯仿抽提直接 (10—40 mL) 加载进 50 mL Super loop；
- 梯度洗脱：
0—70 mL (0%B，1 mL/min) 将样品加载到柱上；
70—100 mL (0%—10%B，2 mL/min) 将 不结合 的 rNTP 从 柱 上 流穿 ；
100—380 mL (10%—30%B，2 mL/min) 分离小的流产转录物；
380—410 mL (30%—100%B，4 mL/min)，分离目标RNA产物和质粒 DNA 模板；
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 28978245 | HiScreen DEAE FF | 1 × 4.7 mL |
| 填料 | 17070910 | DEAE Sepharose FF | 25 mL |
