作者：Sean A McKenna et al.
发表日期：2007年12月
发表期刊：Nature Protocols

研究背景

RNA 的生物物理和结构研究通常需要毫克量的纯物质。大于 20—30 nt RNA 分子的大规模化学合成在技术上任是困难且昂贵的。大多数大于 20 nt 的 RNA 通过使用噬菌体 T7 RNA 聚合酶，从 DNA 模板上转录合成。

转录的 RNA 不是化学纯的。T7 RNA 聚合酶在起始阶段产生短的流产转录物，在延伸阶段产生提前终止产物；在转录几个小时内，RNA 会产生水解产物；T7 聚合酶通常在转录的 RNA 的 3’ 末端添加额外的非模板化核苷酸；

传统上用制备型凝胶电泳纯化 RNA 。尽管这种方法提供了高达100nt RNA的核苷酸分辨率，但它是耗时的，并且导入与RNA相关的丙烯酰胺杂质。此外，酚/氯仿提取及沉淀凝胶电泳后的 RNA 可导致聚集。

基于质粒的转录和 FPLC 凝胶过滤柱的组合为 RNA 的纯化提供了一种有效的方法。本文，使用 Superdex 75 或Superdex 200 凝胶过滤色谱进行 FPLC 纯化。其消除了纯化时对 PAGE 和伴随杂质的要求，同时大大加快了RNA 纯化速度。可以纯化毫克量的不含丙烯酰胺污染物的大 RNA (＞30nt)。此外，该方法是非变性的，其允许从寡聚 RNA 中排他性地分离单体 RNA，并且避免了可能引起 RNA 聚集的苛刻的沉淀步骤。我们的技术在区分具有异源末端的转录 RNA 的能力方面受到限制，但这种限制可以通过将适当的核酶整合到转录物中来克服。该方案在 RNA 的结构、生化和生物物理研究中具有广泛的应用。

实验方法

转录反应：1 × 转录 buffer，8 mM NTPS (ATP，GTP，CTP，UTP；各2 mM) 和 2.5 μg 线性化模板，T7 RNA聚合酶 2.0 毫升，加纯水至终体积为 50 mL。在 37°C 下孵育 2—4 小时。室温离心 (3000 g，5 min) 除去焦磷酸盐沉淀，并保留上清液。加入过量的 EDTA 至 50 mM 的终浓度来完全淬灭反应。向淬灭的反应物中加入等体积的苯酚/氯仿 (1 : 1) ，在室温下翻转并离心 (3000 g，10 min) 。保留水(上)相，从而除去限制酶和 T7 RNA 聚合酶。重复萃取 2—3 次。

脱盐：用 20 mL RNA buffer 平衡脱盐柱。将 3 mL 保留的水相载入脱盐柱中。将 1 mL RNA buffer 冲洗柱。用 5 mL RNA buffer从柱中洗脱所需的 RNA 转录物。

FPLC 凝胶过滤层析：上样，将脱盐后的转录样品注入 50 mL super loop 中；洗脱，注射样品后，以 2 mL/min的恒定流速用从 Superdex PR 200 26/60 (120—400 NT) 或 Superdex 75 P 26/60 (10 —150NT) 凝胶过滤柱中洗脱RNA 转录物，监测 260 和 280 nm 处的吸光度读数以检测含核酸物质，收集 5 mL 的馏分。收集的 RNA 洗脱峰可以通过进一步凝胶色谱(选择合适大小的凝胶柱)测定样品的聚集状态，分离 RNA 单体。

产品信息

Reference
McKenna SA, Kim I, Puglisi EV, Lindhout DA, Aitken CE, Marshall RA, et al.Purification and characterization of transcribed RNAs using gel filtrationchromatography. Nat Protoc 2007;2(12):3270–7