作者:Sean A McKenna et al.
发表日期:2007年12月
发表期刊:Nature Protocols
研究背景
RNA 的生物物理和结构研究通常需要毫克量的纯物质。大于 20—30 nt RNA 分子的大规模化学合成在技术上任是困难且昂贵的。大多数大于 20 nt 的 RNA 通过使用噬菌体 T7 RNA 聚合酶,从 DNA 模板上转录合成。
转录的 RNA 不是化学纯的。T7 RNA 聚合酶在起始阶段产生短的流产转录物,在延伸阶段产生提前终止产物;在转录几个小时内,RNA 会产生水解产物;T7 聚合酶通常在转录的 RNA 的 3’ 末端添加额外的非模板化核苷酸;
传统上用制备型凝胶电泳纯化 RNA 。尽管这种方法提供了高达100nt RNA的核苷酸分辨率,但它是耗时的,并且导入与RNA相关的丙烯酰胺杂质。此外,酚/氯仿提取及沉淀凝胶电泳后的 RNA 可导致聚集。
基于质粒的转录和 FPLC 凝胶过滤柱的组合为 RNA 的纯化提供了一种有效的方法。本文,使用 Superdex 75 或Superdex 200 凝胶过滤色谱进行 FPLC 纯化。其消除了纯化时对 PAGE 和伴随杂质的要求,同时大大加快了RNA 纯化速度。可以纯化毫克量的不含丙烯酰胺污染物的大 RNA (>30nt)。此外,该方法是非变性的,其允许从寡聚 RNA 中排他性地分离单体 RNA,并且避免了可能引起 RNA 聚集的苛刻的沉淀步骤。我们的技术在区分具有异源末端的转录 RNA 的能力方面受到限制,但这种限制可以通过将适当的核酶整合到转录物中来克服。该方案在 RNA 的结构、生化和生物物理研究中具有广泛的应用。
实验方法
转录反应:1 × 转录 buffer,8 mM NTPS (ATP,GTP,CTP,UTP;各2 mM) 和 2.5 μg 线性化模板,T7 RNA聚合酶 2.0 毫升,加纯水至终体积为 50 mL。在 37°C 下孵育 2—4 小时。室温离心 (3000 g,5 min) 除去焦磷酸盐沉淀,并保留上清液。加入过量的 EDTA 至 50 mM 的终浓度来完全淬灭反应。向淬灭的反应物中加入等体积的苯酚/氯仿 (1 : 1) ,在室温下翻转并离心 (3000 g,10 min) 。保留水(上)相,从而除去限制酶和 T7 RNA 聚合酶。重复萃取 2—3 次。
脱盐:用 20 mL RNA buffer 平衡脱盐柱。将 3 mL 保留的水相载入脱盐柱中。将 1 mL RNA buffer 冲洗柱。用 5 mL RNA buffer从柱中洗脱所需的 RNA 转录物。
FPLC 凝胶过滤层析:上样,将脱盐后的转录样品注入 50 mL super loop 中;洗脱,注射样品后,以 2 mL/min的恒定流速用从 Superdex PR 200 26/60 (120—400 NT) 或 Superdex 75 P 26/60 (10 —150NT) 凝胶过滤柱中洗脱RNA 转录物,监测 260 和 280 nm 处的吸光度读数以检测含核酸物质,收集 5 mL 的馏分。收集的 RNA 洗脱峰可以通过进一步凝胶色谱(选择合适大小的凝胶柱)测定样品的聚集状态,分离 RNA 单体。
产品信息
类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
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预装柱 | 28989336 | HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | 1 × 320 mL |
填料 | 17104301 | Superdex 200 pg | 150 mL |
预装柱 | 28989334 | HiLoad 26/600 Superdex 75 pg | 1 × 320 mL |
填料 | 17104401 | Superdex 75 pg | 150 mL |