作者：INSIL KIM et al.
发表日期：2007年2月
发表期刊：RNA

研究背景

RNA 寡核苷酸通常用 T7 RNA 聚合酶从 DNA 模板进行体外转录来制备。

通常，转录后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 从转录副产物中分离所需 RNA 产物。虽然这种方法是成功的，但它有几个缺点：

首先，这种冗长的方案需要多天来纯化单个 RNA 样品；其次，水溶性丙烯酰胺低聚物（来自PAGE的污染物），很难从 RNA 样品中除去；此外，由于 RNA 在转录反应后沉淀并在变性条件下纯化，较大的 RNA 不可逆地聚集，高达 90% 的 RNA 会丢失。

后来，为了克服 PAGE 纯化的这些缺点，开发了开放柱体积排阻色谱法来纯化 RNA，它不需要 RNA 变性。这种方法产生了适合于结构研究的不含丙烯酰胺的 RNA 样品。然而，该方法也并不理想：

首先，酚/氯仿提取后的浓缩不仅是一个耗时的步骤，而且还会导致 RNA 聚集和样品损失。第二，在以前的方法中使用的开放柱是耗时的并且分辨率低。

本研究，我们在快速高效液相色谱 (FPLC) 系统中使用体积排阻色谱柱，从转录反应体系中快速分离均一的、毫克量的纯 RNA。FPLC 系统中尺寸排阻柱的另一个优点是它们的高分辨率，通过选择合适的尺寸排阻柱，我们展示了不同大小的RNA 寡核苷酸的高分辨率分离。这种方法应该会在涉及 RNA 的结构生物学和生物物理学研究中被广泛使用。

实验方法

线性化的质粒作为模板用于T7聚合酶催化的体外转录中。转录反应体系：在 37°C 下孵育 2 或 3 小时后，离心使焦磷酸盐沉淀(3000 g × 10 min)，加入 EDTA 螯合 Mg2+ 来淬灭酶促反应。

向上清液中加入等体积的苯酚/氯仿并离心 (3000 g × 10 min)，将线性化的质粒 DNA 携带的限制性酶、T7 RNA聚合酶一起从反应混合物中除去。在 2-3 次苯酚/氯仿提取后，将上层水相直接上样到脱盐柱(10DG柱)上。用20 mL 10 mM磷酸盐缓冲液 (pH = 6.5) 和 100 mM NaCl 平衡后将 3 mL 样品装载到脱盐柱中。在全部样品进入脱盐柱后，丢弃最初的 2 mL 流出物。然后用 5ml 缓冲液洗脱 RNA 转录物。在脱盐后，3 mL 转录反应物最终被稀释至 5 mL。用 20 mL 相同的缓冲液洗涤脱盐柱，可以再生使用。收集脱盐的 RNA 组分并直接加载到Superdex 200 (26/60) 或 Superdex 75 (26/60) 柱上。为了达到质粒模板和 NTP 污染物与 RNA 洗脱峰的最佳分辨率，建议最大上样体积为15 mL，尽管通常可以加载高达 30 mL 的样品也没有显著困难。用 10 mM 磷酸盐缓冲液 (pH = 6.5) 和 100 mM NaCl 平衡层析柱。以 3 mL/min 流速进行层析，收集 5 mL 馏分。所有实验均在 4°C下进行。将含有所需 RNA 的馏分合并并用 Vivaspin 15R 离心浓缩。

产品信息

Reference
Kim I, McKenna SA, Puglisi EV, Puglisi JD. Rapid purification of RNAs using fast performance liquid chromatography (FPLC). RNA 2007;13:289–94.