作者:INSIL KIM et al.
发表日期:2007年2月
发表期刊:RNA


研究背景

RNA 寡核苷酸通常用 T7 RNA 聚合酶从 DNA 模板进行体外转录来制备。

通常,转录后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 从转录副产物中分离所需 RNA 产物。虽然这种方法是成功的,但它有几个缺点:

首先,这种冗长的方案需要多天来纯化单个 RNA 样品;其次,水溶性丙烯酰胺低聚物(来自PAGE的污染物),很难从 RNA 样品中除去;此外,由于 RNA 在转录反应后沉淀并在变性条件下纯化,较大的 RNA 不可逆地聚集,高达 90% 的 RNA 会丢失。

后来,为了克服 PAGE 纯化的这些缺点,开发了开放柱体积排阻色谱法来纯化 RNA,它不需要 RNA 变性。这种方法产生了适合于结构研究的不含丙烯酰胺的 RNA 样品。然而,该方法也并不理想:

首先,酚/氯仿提取后的浓缩不仅是一个耗时的步骤,而且还会导致 RNA 聚集和样品损失。第二,在以前的方法中使用的开放柱是耗时的并且分辨率低。

本研究,我们在快速高效液相色谱 (FPLC) 系统中使用体积排阻色谱柱,从转录反应体系中快速分离均一的、毫克量的纯 RNA。FPLC 系统中尺寸排阻柱的另一个优点是它们的高分辨率,通过选择合适的尺寸排阻柱,我们展示了不同大小的RNA 寡核苷酸的高分辨率分离。这种方法应该会在涉及 RNA 的结构生物学和生物物理学研究中被广泛使用。

实验方法

线性化的质粒作为模板用于T7聚合酶催化的体外转录中。转录反应体系:在 37°C 下孵育 2 或 3 小时后,离心使焦磷酸盐沉淀(3000 g × 10 min),加入 EDTA 螯合 Mg2+ 来淬灭酶促反应。

向上清液中加入等体积的苯酚/氯仿并离心 (3000 g × 10 min),将线性化的质粒 DNA 携带的限制性酶、T7 RNA聚合酶一起从反应混合物中除去。在 2-3 次苯酚/氯仿提取后,将上层水相直接上样到脱盐柱(10DG柱)上。用20 mL 10 mM磷酸盐缓冲液 (pH = 6.5) 和 100 mM NaCl 平衡后将 3 mL 样品装载到脱盐柱中。在全部样品进入脱盐柱后,丢弃最初的 2 mL 流出物。然后用 5ml 缓冲液洗脱 RNA 转录物。在脱盐后,3 mL 转录反应物最终被稀释至 5 mL。用 20 mL 相同的缓冲液洗涤脱盐柱,可以再生使用。收集脱盐的 RNA 组分并直接加载到Superdex 200 (26/60) 或 Superdex 75 (26/60) 柱上。为了达到质粒模板和 NTP 污染物与 RNA 洗脱峰的最佳分辨率,建议最大上样体积为15 mL,尽管通常可以加载高达 30 mL 的样品也没有显著困难。用 10 mM 磷酸盐缓冲液 (pH = 6.5) 和 100 mM NaCl 平衡层析柱。以 3 mL/min 流速进行层析,收集 5 mL 馏分。所有实验均在 4°C下进行。将含有所需 RNA 的馏分合并并用 Vivaspin 15R 离心浓缩。

产品信息

类别 货号 产品名称 规格
预装柱 28989336 HiLoad 26/600 Superdex 200 pg 1 × 320 mL
填料 17104301 Superdex 200 pg 150 mL
预装柱 28989334 HiLoad 26/600 Superdex 75 pg 1 × 320 mL
填料 17104401 Superdex 75 pg 150 mL

Reference
Kim I, McKenna SA, Puglisi EV, Puglisi JD. Rapid purification of RNAs using fast performance liquid chromatography (FPLC). RNA 2007;13:289–94.