作者：JIRI KOUBEK et al.
发表日期：2013年10月
发表期刊：RNA
研究背景
RNA 相关研究通常需要纯 RNA 进行结构和生化研究。对于 RNA 生成，体外转录通常是首选方法，而不是过表达，因为难以维持细胞内产生的 RNA 的稳定性。
纯化转录产物通常是危险和繁琐的，往往需要多次酚：氯仿提取和聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 。另外，乙醇沉淀的 RNA 可以形成聚集体，并且经常被丙烯酰胺低聚物污染。
不同类型的层析技术已经在细胞 RNA 的纯化中被使用。特别是在从总细胞 RNA 中纯化 tRNA 和用于晶体学研究的过表达 tRNA。随着体外转录的出现和短 RNA 分子 (< 40 nt) 生物学意义的显现，HPLC 已被用于纯化短RNA 转录物以进行 NMR 结构研究。将锤头状核酶添加到序列中可克服 HPLC 纯化中短 RNA 的长度限制。Kieft和 Batey (2004) 开发了使用连接到靶 RNA 的 3′ 末端的标签的亲和纯化。Lukavsky 和 Puglisi (2004) 还开发了用大小排阻层析纯化 RNA 转录物的不同方法。该技术可以从所需的全长单体转录物中除去未反应的核苷酸、酶、短流产转录物、寡聚RNA、RNA 聚集体和质粒。
在本研究，展示了在转录纯化和转录反应研究中使用强阴离子交换 (Mono Q) FPLC 的普遍性。通过将转录反应混合物直接施加到柱上，可以容易地从模板 DNA 中分离未反应的 rNTP、短流产转录物和所需转录物。已经成功地将该方法应用于多种不同链长的 RNA，包括 tRNA 、核酶转录物和 4.5S RNA 转录物。转录物生物功能的验证也已经完成，正如氨酰化分析所证实的，强阴离子交换具有高分离能力。最后，做为研究的一部分，比较了该方法与弱阴离子交换 FPLC 的性能。
实验方法
焦磷酸酶基因的克隆与纯化：克隆细胞培养液加入裂解缓冲液 (20 mM HEPES，250 mM NaCl，pH = 7.5) 裂解后离心。将上清液加载到用裂解液预平衡好的Sepharose Ni2+ column (3 mL) 中，依次用含有10 mM，50 mM，200 mM，500 mM咪唑的裂解液洗脱4个CV，3 CV，3 CV，3 CV。收集洗脱组分并用PD-10脱盐柱进行换液，用3 KD的超滤膜进行浓缩。进一步上样到anion-exchange Mono Q 柱，去除核酸污染物。
转录模板的制备以及转录反应条件筛选(略)；
RNA转录、纯化和产物分析：
将转录反应混合物直接加到预平衡的Mono Q柱上，用线性NaCl梯度洗脱。应用的洗脱程序包括线性梯度0.02—1.02 M NaCl，0.32—0.82 M NaCl和0.46—0.62 M NaCl。在254 nm处监测吸光度，收集1 mL馏分。
或者，在DEAE Sepharose柱纯化转录物。将反应混合物直接应用于0.26 M NaCl预平衡好的柱上，通过0.26至0.42 M NaCl线性梯度洗脱产物，收集1mL馏分。
通过12%或15% NaOAc Urea PAGE (0.15 M NaOAc，7 M尿素，pH = 5.5)，2% TBE-尿素PAGE (89 mM Tris，89 mM硼酸盐，1 mM EDTA，7 M尿素，pH = 8.3)和2% TBE琼脂糖凝胶分析转录产物。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 17524801 | HisTrap HP | 1 × 5 mL |
| 填料 | 17526801 | Ni Sepharose HP | 25 mL |
| 预装柱 | 17085101 | PD-10 Desalting Columns | 30 × 8.3 mL |
| 预装柱 | 28926978 | HiScreen Capto Q | 1 × 4.7 mL |
| 填料 | 17531610 | Capto Q | 25 mL |
| 预装柱 | 28978245 | HiScreen DEAE FF | 1 × 4.7 mL |
| 填料 | 17070910 | DEAE Sepharose FF | 25 mL |
