作者：Yau Sang Chan et al.
发表日期：2015年9月
发表期刊：Chinese Medicine
研究背景
通过四步层析纯化实验，能够从green speckled lentil seeds (Lens culinaris) 绿色斑点扁豆种子中提取出凝集素Green speckled lentil seeds lectin (GSLL)，该凝集素蛋白对甘露糖具有亲和力，对癌细胞CNE1具有明显的抑制生长作用，并促进癌细胞的细胞凋亡，这些作用依赖甘露糖结合能力。将纯化后的GSLL通过carbohydrate specificity test，实验显示，凝集素GSLL与血红细胞的结合的凝集作用可以被葡萄糖和甘露糖竞争性的抑制，说明GSLL是一个能够特异识别葡萄糖和甘露糖的凝集素。细胞增殖测试MTT assay实验证明，加入纯化后的GSLL抑制CNE1癌细胞的增殖。通过WB实验证明，加入GSLL后CNE1细胞的caspase 389表达上调诱导细胞发生凋亡。在MTT assay实验中，加入葡萄糖和甘露糖，将减弱GSLL对CNE1细胞抑制增殖的作用，表明GSLL对CNE1细胞的增殖抑制作用可能与GSLL的凝集能力有关。
实验方法
将80 g的Green speckled lentil seeds绿色斑点扁豆种子用buffer (10 mM Tris-HCl，pH = 7.6)浸泡过夜，经过匀浆后，两次30000g4度离心25 min，得到800 mL的上清液为凝集素粗提液。
粗提液首先利用SP Sepharose离子交换层析纯化，填料装成5 cm × 15 cm柱型，样品经过SPSepharose流穿，平衡流穿缓冲液为10 mM Tris-HCl buffer，pH = 7.6。
流穿的样品接着利用Blue亲和层析初纯，填料装成5 cm × 15 cm柱型，结合缓冲液10 mM Tris–HCl buffer (pH = 7.6)，平衡层析柱和上样洗杂后，利用洗脱缓冲液10 mM Tris–HCl buffer (pH = 7.6)与1M NaCl等度洗脱，洗脱的样品加入2倍体积的纯水稀释后冻干。
冻干的样品复溶后，利用5 cm × 15 cm预装柱精纯，平衡缓冲液10 mM Tris–HCl buffer (pH = 7.6)，上样和洗杂后用洗脱缓冲液10 mM Tris–HCl buffer (pH = 7.6)，1M NaCl线性梯度洗脱，洗脱的样品经过透析和冻干。
样品复溶后，最后利用Superdex 75 10/300 分子筛预装柱精纯，分子筛缓冲液10 mM Tris–HCl buffer (pH = 7.6)。
纯化后的GSLL，通过蛋白胶检测确定，其含两个结构域，17 kDa和4 kDa，总长为21 kDa。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 28936544 | HiPrep SP FF 16/10 | 1 × 20 mL |
| 填料 | 17072910 | SP Sepharose FF | 25 mL |
| 空柱 | 28988952 | Colume XK 50/20 | 50/20 |
| 预装柱 | 28992474 | HiScreen Capto Blue | 1 × 4.7 mL |
| 填料 | 17544801 | Capto Blue | 25 mL |
| 预装柱 | 29275878 | Capto HiRes Q | 1 × 1 mL |
| 预装柱 | 29148721 | Superdex 75 Increase 10/300 GL | 1 × 24 mL |
