作者：Vitalia V. Kulikova et al.
发表日期：2019年07月
发表期刊：International Union of Biochemistry and Molecular Biology

研究背景

依赖于吡哆醇50-磷酸 (PLP) 的酶催化氨基酸转化的化学反应，因此在许多代谢过程中发挥关键作用，可以从直接巯基化和超硫化的微生物中蛋氨酸生物合成的两种途径中看出，依赖于plp的胱硫氨酸γ-合成酶 (CGS, EC 2.5.1.48) 和半胱氨酸-s共轭β-裂解酶 (CBL, EC 4.4.1.13) 是超硫化途径中的关键酶，而o-乙酰高丝氨酸巯基化酶 (OAHS, EC 2.5.1.49) 在巯基化途径中参与蛋氨酸生物合成。到目前为止，谷氨酸棒状杆菌是唯一利用这两种途径合成蛋氨酸的细菌。

o-乙酰高丝氨酸巯基水解酶 (OAHS) 是一种吡哆醇50-磷酸依赖酶，参与微生物蛋氨酸的生物合成。本文报道了艰难梭状芽孢杆菌OAHS的基因克隆、蛋白纯化及部分生化特性。该酶是一种分子量为185 kDa的四聚体。它在l-同型半胱氨酸合成反应中具有较高的活性，与其他来源报道的OAHSes活性相当。代谢终产物l-蛋氨酸可抑制OAHS活性。l-丙炔甘氨酸被发现是一种自杀抑制剂的酶。底物类似物n γ-乙酰基-l-2,4-二氨基丁酸是一种竞争性的OAHS抑制剂，Ki = 0.04 mM。对艰难梭菌基因组的分析表明，该细菌使用直接巯基化的方式合成Lmethionine。所得数据可为进一步研究OAHS在病原菌中的作用及开发潜在抑制剂提供依据。

实验方法

收获原料：

在大肠杆菌中诱导表达24小时，收集的细胞重悬于缓冲液pH为7.5，含有1 mm DTT，1 mm EDTA和0.1 mM PLP。超声破碎溶液稀释至蛋白浓度为10 mg/mL，用2%的硫酸鱼精蛋白溶液在室温下搅拌，沉淀核酸30分钟。低温离心澄清，溶液通过0.45 mm醋酸纤维素滤器过滤。

纯化步骤：

采用HiPrep DEAE FF 16/10层析柱对酶进行离子交换层析纯化，结合缓冲液 (50 mM磷酸钾，pH 7.5，含1 mM DTT、1 mM EDTA和0.1 mM PLP)，在同一缓冲液中加200 mM KCl洗脱。将OAHS的峰组分进行收集和浓缩。检测纯度95%纯酶制剂的OAHS与共底物Na2S γ取代反应的比活为50单位/mg。

低聚物的测定：

在Superose 6 Increase 10/300 GL色谱柱上通过凝胶过滤测定酶的分子量。用50 mM磷酸钾缓冲液，pH 7.5，含1 mM DTT，1 mM EDTA和0.1 mM PLP进行洗脱。

产品信息

Reference
Kulikova VV, Revtovich SV, Bazhulina NP, et al. Identification of O-acetylhomoserine sulfhydrylase, a putative enzyme responsible for methionine biosynthesis in Clostridioides difficile: Gene cloning and biochemical characterizations. IUBMB Life. 2019;71:1815–1823.