作者:Damiano Migani et al.
发表日期:2017年03月
发表期刊:Wiley Online Library, on behalf of American Institute of Chemical Engineers


研究背景

葡萄糖苷酶是生物体内糖代谢途径中的重要成员之一,葡萄糖苷酶能水解寡糖底物生成葡萄糖被人体代谢利用,α-葡萄糖苷酶更是直接参与淀粉及糖原的代谢途径。重组人酸性α-葡萄糖苷酶GAA,用于治疗庞贝病的关键酶,病因是细胞溶酶体中GAA的遗传性缺失,使糖原及麦芽糖不能转化为葡萄糖而被利用,以致体内大量糖原在骨骼肌、心肌和平滑肌等组织细胞内聚积而致病。

生产GAA的工艺过程十分挑战,因为GAA常被来自宿主的蛋白酶降解。因此研究GAA在宿主中的表型和HCPs的残留问题非常关键,通过质谱和酶谱分析寻找任何有关蛋白降解的HCPs。

根据法规相关规定,生物药制品对于宿主HCPs有着明确的检测上限规定,例如纯化的单抗mAb样品,<100 ppm HCP,<10 ng/dose DNA,<5% product aggregates等。一些HCPs会与目标分子共同被纯化出来,特别是有一些具有蛋白酶活性的杂质会对样品造成降解。

实验方法

在CHO细胞中重组构建和表达人的酸性α-葡萄糖苷酶,37℃摇瓶培养8 days后收获培养上清。

2000 g离心10 min收集上清,0.22 μm过滤,10 kDa cutoff截留分子量超滤,浓缩4倍。West blot检测GAA表达的存在。

使用1 mL HiTrap Capto Q阴离子交换层析对1:4稀释的GAA样品进行捕获。缓冲液为50 mM sodium acetate pH 6.0 (Buffer A),1 M sodium chloride in 50 mM sodium acetate pH 6.0 (Buffer B),流速为1 mL/min。

洗脱策略为:14 CV wash (100% buffer A),40 CV linear gradient elution (0 - 35% buffer B),5 CV strip (100% Buffer B),regeneration (10 CV 0.5 M NaOH, 5 CV Buffer A, 10 CV 20% EtOH)。

通过ELISA对宿主HCPs残留进行检测,相比其他文献的纯化方法:阴离子交换层析Mono Q和亲和层析Con A Sepharose 4B法,此法也具有很好的纯度和回收率。最后利用高分辨率LC-MS/MS和酶谱进行蛋白水解活性HCPs组分的分析。

产品信息

类别 货号 产品名称 规格
预装柱 29275881 Capto HiRes Q 10/100 1 x 8 mL
预装柱 11001303 HiTrap Capto Q 5 x 5 mL
预装柱 28952096 HiTrap Con A 4B 5 x 5 mL

Reference
Damiano Migani,C. Mark Smales,Daniel G. Bracewell. Effects of lysosomal biotherapeutic recombinant protein expression on cell stress and protease and general host cell protein release in Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. Prog., 2017, Vol. 33, No. 3